小麦 TaCYP78A5基因的克隆及生物信息学分析

郑雅月,杨 璐，张炳慧，赵万春,2，董 剑,2，高 翔,2，李晓燕,2(.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 7200；2.陕西省小麦工程技术研究中心/陕西省小麦新品种培育工程研究中心，陕西杨凌 7200)

小麦产量由单位面积穗数、穗粒数和千粒质量3因素构成，其中千粒质量在产量构成因素中受遗传特性的影响最大，广义遗传力高达59%～80%[1]。小麦籽粒大小影响千粒质量的形成，属于受多基因控制的数量性状[2]。在前人的研究中，利用不同的群体材料，小麦籽粒大小和产量相关的QTL被鉴定出来。例如，Kumar等[3]将控制粒质量的QTL定位在1AS、2BS、7AS上，这些QTL可解释9.06%～19.85%的表型变异；王瑞霞等[4]在多个环境下将21个与千粒质量相关的 QTL定位在小麦1A、1B、2A、2D、3B、4A、4D、5A、6D和7D染色体上。这些QTL的鉴定与定位，为小麦籽粒大小基因的精细定位与克隆奠定了很好的前期基础。

目前，对于小麦籽粒大小相关基因的克隆已经取得了一些进展。Song等[5]研究发现，水稻粒宽基因(OsGW2)的同源基因TaGW2通过控制种子发育影响千粒质量。常成等[6]在小麦中克隆了水稻GS3的同源基因PEBP-like基因，发现PEBP-like基因的变异对籽粒的大小以及粒质量产生影响。Wang等[7]克隆了水稻籽粒大小基因OsGS5的同源基因TaGS5，TaGS5-A1与粒宽、粒质量相关，TaGS5-A1b等位基因在种子发育的各个时期其表达量均高于TaGS5-A1a。在水稻中，许多与种子大小相关的基因已经被克隆和功能研究；但在小麦中种子大小相关基因的功能研究还未深入，小麦籽粒大小形成缺乏相应的分子证据。因此，对小麦籽粒大小相关基因进行克隆，并对这些基因如何调控小麦籽粒大小的形成进行解析，是阐释小麦籽粒大小形成的分子机制的重要前提。

细胞色素P450(Cytochromes P450)是植物中最大的蛋白家族之一[8]。对细胞色素P450的研究发现，CYP78A家族成员具有控制籽粒大小的功能[9-13]。拟南芥中CYP78A5/KLUH基因控制种子的大小，其作用独立于其他母系因素，通过促进种皮细胞增殖而决定种子大小[9]。拟南芥中CYP78A9基因也是通过控制胚珠和种子发育阶段表皮细胞的增殖，进而控制种子表皮的大小，影响种子的大小[13]。在水稻中CYP78A13通过调节胚与胚乳之间的大小平衡来调节种子的大小，CYP78A13基因功能缺失突变体的种子胚增大但胚乳减小，而过表达CYP78A13则会导致种子的胚减小和胚乳增大[12,14]；番茄中CYP78A5/KLUH的同源基因SlKLUH也通过增加细胞数量调控果实大小[15-17]。前人通过遗传和蛋白结构分析认为CYP78A家族成员之间具有相似功能，然而，小麦中关于CYP78A5的功能研究报道还比较少，CYP78A5基因在小麦中对种子生长发育的调控机理还未被揭示。本研究通过克隆小麦不同籽粒大小材料中CYP78A5基因，分析TaCYP78A5在大粒小麦‘P271’和小粒小麦‘中国春’(‘CS’)序列变异，并进行生物信息学分析，探究其在小麦种子大小形成中的作用，为小麦中细胞色素P450基因调控种子大小提供新的证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦大粒材料‘P271’和小粒材料‘中国春’(‘CS’)均由西北农林科技大学农学院小麦品质遗传育种实验室提供(图1)。将‘中国春’和‘P271’小麦种子用质量分数为3%的次氯酸钠消毒，然后利用体积分数1%的H2O2溶液催芽处理后在培养箱中培养。2周后，取幼嫩的叶片提取DNA。2016年10月，‘中国春’和‘P271’按常规方法种植在杨凌小麦综合试验站实验田，进行常规播种与田间管理。

1.2 试验方法

1.2.1 籽粒表型测定 籽粒的粒长、粒宽、千粒质量均由万深SC-A型种子自动考种仪千粒质量仪测定，表1所示的数据结果是284粒‘中国春’籽粒和285粒‘P271’籽粒经仪器测量和软件处理所得。

1.2.2 总DNA提取 采用CTAB法[18]提取小麦叶片基因组总DNA。

1.2.3 引物设计和基因克隆 根据NCBI中已公布的基因序列号KT266824.1，采用Primer premier 5.0软件设计特异性引物TaCYP78A5-F和TaCYP78A5-R，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以‘中国春’和‘P271’幼苗中提取的DNA为模板，用引物进行PCR扩增，按2×EsTaqMasterMix (CWBIO)说明书配制反应体系25.0 μL，含2×TaqMasterMix 12.5 μL、10 μmol·L-1上下游引物各2.0 μL、DNA 2.0 μL、ddH2O 6.5 μL。扩增程序为 95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30个循环，72 ℃ 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收目标产物，将目的片段与克隆载体PEASY-T1(TransGen Biotech)连接并转化入感受态细胞Transl-T1中，筛选阳性单克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4TaCYP78A5基因生物信息学分析 利用NCBI中BLAST在线软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRA)进行基因序列比对分析，利用NCBI中ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测序列开放阅读框，利用DNAMAN 7.0进行基因序列及蛋白质序列比对，在NCBI中CDD(http s:// www. ncbi . nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)在线预测氨基酸序列保守结构域，利用ProtParam进行蛋白质一级序列分析(http://web.expasy.org/protparam/)，利用NPS@网站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl=/NPSA/npsa_sopma.html)预测蛋白质二级结构，利用SWISS-MODEL软件(https://swissmodel.expasy.org/ repository)预测蛋白质三级结构。利用pfam预测蛋白质的信号肽(http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)，利用TMHMM预测蛋白质的跨膜区(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)。利用CYP78A5基因全长及其推导的氨基酸序列，在GenBank数据库查找其同源序列，发现近缘物种中已克隆CYP78A家族的基因序列，通过MEGA 5.0的最大似然法(Maximum Likelihood method)构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 籽粒表型变异

利用自动考种仪千粒质量仪测量‘中国春’和‘P271’种子。经过仪器自带的软件处理得出‘中国春’籽粒的平均宽度为2.59 mm，平均长度为5.32 mm，千粒质量为27.68 g，而‘P271’籽粒的平均宽度3.54 mm，平均长度为7.59 mm，千粒质量为57.48 g，‘P271’的籽粒长、宽、千粒质量都明显高于‘中国春’(表 1)。因此，本试验将‘中国春’作为小粒材料，‘P271’作为大粒材料研究TaCYP78A5基因与小麦籽粒大小形成的关系。

图1 小麦‘CS’和‘P271’的籽粒粒型

表1 ‘CS’和‘P271’籽粒的表型数值

2.2 TaCYP78A5基因克隆和序列分析

以特异性引物TaCYP78A5-F:TCTTTCCATGGTTACCGGCC和TaCYP78A5-R:CAG- CTCTCTCTGGCCCTAG扩增得到‘中国春’和‘P271’的TaCYP78A5基因序列各18个，这18条序列聚集成3类，将3类序列提交到小麦资源库(https://urgi.versailles.inra.fr /blast/blast.php)进行BLAST比对，分别定位到小麦2AS、2BS、2DS染色体上，命名为TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D。将TaCYP78A5基因的氨基酸序列在NCBI进行比对，结果显示TaCYP78A5属于细胞色素P450家族成员(图2-A)。利用NCBI中ORF Finder预测序列开放阅读框，TaCYP78A5与其他CYP78A家族成员一样均由2个外显子和1个内含子组成，不同染色体上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D序列之间显示出98.17%的高度相似性。TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D的编码区长度分别为1 608、1 638和1 650 bp，编码534、544、549个氨基酸(图2-B)。

2.3 TaCYP78A5的蛋白结构预测

利用Protparam网站进行TaCYP78A5蛋白质3个染色体组上序列一级序列理化性质预测如表2，结果显示蛋白不稳定系数大于40，亲水性均为正值，说明TaCYP78A5蛋白可能是不稳定的脂溶性疏水蛋白，且3条染色体上的结果相一致。利用NPS@的SOPMA网站预测TaCYP78A5蛋白序列的二级结构，以TaCYP78A5-2A为例，如图3-A中的预测结果表明，α-螺旋比例最高，达到49.63%左右；29.96%左右为无规则卷曲；伸展链的比例在12.55%，β-转角最少，约占7.87%。二级结构预测，该蛋白主要以α-螺旋和无规卷曲为主，含少量β-转角。TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D的二级结构组成与TaCYP78A5-2A相似度很高，TaCYP78-A5-2B蛋白的α-螺旋、无规则卷曲、伸展链、β-转角分别各占47.79%、28.86%、14.15%、9.19%。TaCYP78A5-2D蛋白的α-螺旋、无规则卷曲、伸展链、β-转角分别各占45.36%、29.87%、16.76%、8.01%。在SWISS-MODEL网页提交TaCYP78A5基因的氨基酸序列，在蛋白结构库中搜索比对模板，得到4i8v.1.A序列与TaCYP78A5氨基酸序列的第48～544个残基的一致性达28%，且4i8v.1.A序列编码蛋白也是P450家族蛋白，具备同源建模的条件。从而得到本研究中TaCYP78A5-2A基因所编码蛋白的三维结构模型如图3-B，TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D蛋白的三级结构组成与TaCYP78A5-2A相似度很高，都是由α-螺旋和两个反向平行的β-折叠及一对β-转角组成。将TaCYP78A5编码的蛋白氨基酸序列输入TMHMM网址进行蛋白跨膜区结构分析，跨膜区预测结果分析表明该蛋白是膜锚定蛋白，具有跨膜结构域，第 1～8 个氨基酸为膜内区域，第 9～31个氨基酸为跨膜区域，其余的均为膜外区域。Pfam的预测结果(图3-C)也表明第 1～44 个氨基酸为信号肽区域，其余的为与数据库比对到的P450家族的序列区域，由此推测TaCYP78A5是一种分泌蛋白。

A.TaCYP78A5基因蛋白家族预测 Proteins prediction ofTaCYP78A5；B.不同植物中CYP78A5氨基酸序列比对，深蓝色区域为保守结构域 Alignment of amino acid sequence of CYP78A5 in different plants,the dark blue regions are conserved domain

图2 小麦CYP78A5蛋白家族预测及推测的氨基酸序列与其他植物的CYP78A5氨基酸序列比对

A.TaCYP78A5-2A蛋白的二级结构，蓝色区域为α-螺旋，紫色区域为无规卷曲，红色区域为伸展链，绿色区域为β-转角 Secondary structure of TaCYP78A5-2A protein,blue area shows alpha helix,purple region as a random coil,the red area is extended strand,the green area is beta turn；B.TaCYP78A5-2A蛋白的三级结构预测 Predicted tertiary structure of TaCYP78A5 protein；C.TaCYP78A5序列匹配和特征 TaCYP78A5 sequence matches and features

图3TaCYP78A5的蛋白结构预测

Fig.3PredictedstructureofTaCYP78A5protein

2.4 CYP78A基因进化分析

根据TaCYP78A5氨基酸序列与NCBI中的同源序列比对，发现TaCYP78A5序列与水稻及节节麦序列达到85%的一致性(图2-B)，其中TaCYP78A5-2D与节节麦的CYP78A5-like(GenBank登录号为XM_020344923)蛋白有很高的一致性(93%)，进一步构建TaCYP78A5和其他已知CYP78A家族成员的系统进化树(图4)，水稻CYP78A13(GenBank登录号为AB780362.1)与水稻CYP78A5(GenBank登录号为XM_015790749)基因聚于一个分支，显示出更高的一致性(100%)。且CYP78A家族的其他基因如CYP78A11在不同单子叶物种中的相似性都比较高，可以推测CYP78A家族在单子叶植物中的功能相对保守。而且Xu等[14]研究显示水稻CYP78A13基因能够在拟南芥中恢复cyp78a5的缺失表型，这表明CYP78A13和CYP78A5可能是直系同源基因。因此，本研究克隆到的TaCYP78A5基因编码一个小麦细胞色素P450蛋白，并且可能是拟南芥CYP78A5的直系同源基因。

3 讨 论

在CYP450家族中，CYP78A与其他成员不同，它参与植物种子发育等植物特异反应[9,12]。通过对一个新的CYP78A5基因突变体的表型观察，证明了CYP78A5基因参与多个生长发育调控途径，包括可能调控植物体的细胞增殖以及发育时期的转换等，而这些调控途径又通过CYP78A5这样的基因形成复杂的调控网络，从而保证植物的正常生长[19]。CYP78A5基因间接调控赤霉素合成代谢相关基因[20]，且不直接调控植物激素如生长素、细胞分裂素以及油菜素内酯等的代谢[19]。

在模式植物拟南芥和水稻中的研究已经证明CYP78A基因家族多个成员如CYP78A5，CYP78A9和CYP78A13等均具有控制种子大小的功能[9,13-14]。在拟南芥中，Adamski等[9]发现了调控籽粒大小的KLUH/CYP78A5，籽粒中过表达KLU基因，种子的体积和质量都会显著增加；而当该基因功能缺失时，种子的体积和质量又会显著降低；KLU基因在花后的胚珠内表皮中表达，通过促进内表皮细胞的增殖，增大表皮细胞的数目，从而达到增大种子表皮的效果，进而增加种子的大小和质量。在水稻中，CYP78A9和其同源基因CYP78A6、CYP78A8，通过促进细胞增殖来调控花器官的生长及种子发育[13,17]。编码CYP78A13的GE基因在平衡胚和胚乳大小方面有重要的影响，GE基因功能缺失后，胚变大而胚乳变小；相反地，CYP78A13蛋白过表达后，胚变小而胚乳变大，从而导致水稻种子增大[12,14]。而水稻的CYP78A13基因能够在拟南芥中恢复cyp78a5的缺失表型，这表明CYP78A13和CYP78A5可能是直系同源基因[14]。

图4 CYP78A家族进化分析

Miyoshi等[21]发现水稻PLA1/CYP78A11基因通过影响顶端分生组织的细胞增殖来调控生殖器官的发育，但在顶端分生组织未检测到CYP78A11基因的表达，CYP78A11基因可能通过非细胞自制模式控制生殖器官发育。Anastasiou等[22]仅在拟南芥叶、花器官基部检测到CYP78A5基因的表达，其促生作用却贯穿整个植株；并提出CYP78A5基因可能依赖于一个可以在细胞间移动的信号，通过非细胞自制模式促进器官生长。相似的，Adamski等[9]发现，PINO:CYP78A5转基因拟南芥植株中仅在胚珠中过表达CYP78A5基因，却导致拟南芥花器官的增大、花序的伸长，这一现象也支持CYP78A5基因非细胞自制的作用模式。

本研究克隆的TaCYP78A5与其他CYP78A家族成员一样均由2个外显子和1个内含子组成，并与水稻中CYP78A5具有很高的相似性。因此，我们可以推测CYP78A5的同源基因TaCYP78A5在小麦中也可能具有在水稻、拟南芥中类似的功能，通过促进胚珠和种子发育阶段表皮细胞增殖来影响种子大小。本研究通过对核酸序列和编码的氨基酸序列比对分析发现‘P271’和‘中国春’克隆到的TaCYP78A5基因序列一致，说明TaCYP78A5基因在这2个粒型的小麦中相对保守。推测TaCYP78A5基因对这2种粒型的小麦的作用可能是通过在小麦‘P271’的根、茎、叶各组织或籽粒发育过程中基因表达量较高引起的，也可能是TaCYP78A5基因的启动子在2个材料中的差异所引起。关于TaCYP78A5基因在小麦中的具体的分子作用机制还需进一步证明。

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