人工养殖暹罗鳄的抗病毒活性研究

田钰琪，王凤林，陈斌，崔小冬，段玉龙，赓迪，王晶，孙艺茹，王春梅※

（1.北京中医药大学生命科学学院生物制药系，北京 100029；2.武警总医院药剂科，北京 100039）

暹罗鳄（Crocodylus siamensis）是鳄科（Crocodylidae）鳄属（Crocodylus）的一种中型鳄鱼，是我国人工养殖较为广泛的种类，成年个体体长2m～3m，体重40kg～70kg。鳄鱼生活环境较为恶劣，充斥各种病原体，其食谱冗杂，捕食之外亦会取食动物尸体，但野生鳄鱼鲜少发现感染细菌、病毒[1]，这一特性与其强大的免疫系统密切相关。鳄鱼的免疫系统和抗逆境能力得到了研究者的广泛关注，对鳄鱼中生物活性物质及其药理作用亦有所阐述[2]。针对鳄鱼血的研究也获得了许多成果，鳄鱼血被认为有良好的抗菌[3]、抗肿瘤[4]、抗氧化[5]效果。当下人工养殖鳄鱼资源丰富[6]，但综合利用度不够，多用于皮革工业及保健功能食品开发[7]。对于人工养殖的鳄鱼血抗病毒作用的研究目前未见报道。本研究选取人类易感且流行性较强的甲型流感病毒、单纯疱疹病毒及乙肝病毒进行抗病毒相关体外研究，为后续深入研究和开发奠定基础。

1 材料、仪器与试剂

人工养殖暹罗鳄来源于海南三亚龙虎园养殖场，由北京洪源澳达投资有限公司提供。

狗肾细胞（MDCK）、非洲绿猴肾细胞（Vero）（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心）；HBV病毒DNA转染的人肝癌细胞株（HepG22.2.15，ATCC）、甲型流感病毒（济防90-15）（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所）；单纯疱疹病毒（HSV-IVR733，ATCC）、鸡胚（北京梅利亚维通实验动物技术有限公司）。

病毒唑、无环鸟苷（ACV）（湖北科益制药厂）；拉米夫定（Lamivdine，LAM，100mg/片，葛兰素史克制药有限公司）；DMEM培养基（GIBCOBRL公司）；胎牛血清（HyClone公司）；双抗、胰酶、DMSO、ELISA试剂盒（北京万泰生物药品公司）

低温冰箱（REVCO公司）；低温高速离心机（赛默飞公司）；二氧化碳培养箱（SANYO公司）；超净工作台（哈尔滨市东联公司）；移液器（Eppendorf公司）；倒置荧光显微镜（Nikon公司）；酶标仪（美国分子仪器公司）。

2 方法

2.1 血清、血浆及白细胞提取物样品制备

鳄鱼颈部窦静脉取全血，加入1/10体积抗凝剂（3.8%枸橼酸钠溶液），3 000r/min离心10min，取上清为血浆；中层少量为白细胞，白细胞层进一步用低渗法除去红细胞后离心，再反复冻融破碎白细胞后为白细胞提取液。取全血，4℃冰箱静置至分层，上层即为血清。

得到的血浆、血清和白细胞提取物过滤除菌，4℃冰箱保存待用。

2.2 病毒培养

将病毒接种于10日龄鸡胚的尿囊中，每个鸡胚接种 0.2mL，35°C 培养72h后，置于 4°C 放置6h，取尿囊液，备用。

2.3 病毒半数组织细胞感染量（TCID50）测定

使用 DMEM 培养基梯度稀释含病毒鸡胚尿囊液，稀释梯度为102～107，96孔板中加入100L胰酶消化的细胞（浓度2×105cell/mL）及100L稀释病毒培养液。37°C，5%CO2培养。观察细胞形态，当病毒细胞病变（CPE）达到++++时，观察并记录结果。采用Reed&Muench方法[8]计算TCID50值。

2.4 样品对各细胞株细胞毒性测定

用MTT方法测定不同稀释浓度血清对细胞的抑制情况，计算血清、血浆、白细胞提取物对MDCK、Vero细胞株的TC50及对HepG22.2.15的TC50

2.5 抗甲型流感病毒活性及抗单纯疱疹病毒活性实验

胰酶消化细胞成单细胞悬液，稀释浓度至2×105cell/mL，取100L接种96孔培养板，5%CO2、37°C培养24h后加入病毒稀释液，至终浓度为100倍TCID50。37℃吸附2h后倾去病毒液，再分别加入不同稀释度样品及相应阳性药物，同时设病毒对照组和细胞对照组。37°C培养48h，观察结果，记录CPE，计算各样品抗甲型流感病毒半数抑制浓度，并比较选择指数（SI）值。

2.6 抗乙肝病毒活性实验

HepG22.2.15细胞100L（5×104cell/mL）接种 96孔板，培养24h后弃上清，加入不同浓度的样品、阳性药及阴性对照培养基。每个样品分为5个浓度（稀释102～106倍），每个浓度重复3个复孔，3d更换培养液1次，共换3次，培养9d后收集细胞上清液，ELISA检测HBV病毒学指标。

2.7 有效性判断

通过计算SI值考察样品有效性，SI=TC50/IC50。SI＜1，药物无效；1＜SI＜2，药物低效有毒；SI＞2，药物有效，SI数值越高，药物安全范围越大。

3 结果

3.1 暹罗鳄血抗甲型流感病毒活性

以鸡胚尿囊膜液为病毒原液，进行倍比稀释后测得甲型流感病毒的TCID50值为106倍稀释浓度。经过MTT实验，测得人工养殖暹罗鳄血浆、血清及白细胞提取物对 MDCK细胞的 TC50分为原液的10%、4.76%及4.76%，故考察样品稀释倍数为102～106浓度对甲型流感病毒的作用。鳄鱼血浆及血清抗甲流病毒SI值为46.33和55.62，表明血浆及血清具有较好的体外抗甲型流感病毒的作用；白细胞提取物在TC50浓度以下未观察到抑制细胞病变的作用，较高浓度即产生细胞毒性，表明白细胞提取物对甲型流感病毒无抑制作用。结果见表1。

表1 暹罗鳄血浆、血清、白细胞提取物对甲型流感病毒作用Tab.1 Effect of plasma，serum，and leukocyte extracts from Siamese crocodile on influenza A virus

3.2 暹罗鳄血抗单纯疱疹病毒活性

单纯疱疹病毒对Vero细胞的TCID50为105倍病毒原液。本实验结果表明，鳄鱼血清、血浆、白细胞提取物在＞100倍稀释时对Vero细胞产生毒性，否则，均对单纯疱疹病毒无抑制作用。

表2 暹罗鳄血浆、血清、白细胞提取物对单纯疱疹病毒作用情况Tab.2 Effect of plasma，serum，and leukocyte extracts from Siamese crocodile on Herpes simplex virus

3.3 暹罗鳄血抗乙肝病毒活性

暹罗鳄血清、血浆和白细胞提取物稀释100倍后作用于hepG22.2.15细胞，不产生细胞毒性，半数毒性浓度（TC50）为原样品的10%。使用拉米夫定50g/mL 作为阳性对照药，ELISA测定作用后乙肝病毒表面抗体抗原HBsAg及乙肝e抗原HBeAg的量，并计算得到的IC50。结果见表3。

表3 暹罗鳄血浆、血清、白细胞提取物对乙肝病毒抗原分泌作用情况Tab.3 Effect of plasma，serum，and leukocyte extracts from Siamese crocodile on antibody exudatiton of Hepatitis B Virus

实验表明，暹罗鳄血清及血浆对乙肝病毒HBsAg及HBeAg的分泌均有抑制作用，白细胞提取物在很低浓度对乙肝病毒HBsAg的分泌有抑制作用明显，但对乙肝病毒HBeAg的分泌无抑制作用。

4 讨论

人工养殖鳄鱼技术成熟，资源丰富。暹罗鳄在我国已经实现产业化养殖[9，10]。2013年，鳄鱼血薄膜衣片保健食品已经上市，相关的药效研究也有利于鳄鱼资源的开发[11]。鳄鱼的抗菌[12]、抗肿瘤[13]、抗病毒研究是研究者关注的主要方向。Merchant研究证明，野生美洲鳄血清及白细胞提取物对HIV病毒[14]、HSV-1病毒均有一定抑制作用。

本研究表明，人工养殖鳄鱼血液有一定体外抗甲型流感病毒及乙肝病毒活性，由本实验结果推断，暹罗鳄鱼血清、血浆中应含有某些抗病毒活性物质，本实验结果为后续深入进行鳄鱼血抗病毒研究提供基础。

[1]JeyamoganS，Khan N A，SiddiquiR.Animals living in polluted environments are a potential source of anti-tumor molecule(s).[J].Cancer Chemotherapy&Pharmacology，2017，80:1-6。

[2]李海航，罗嘉玲，倪贺.鳄鱼资源开发和生物活性物质研究进展[J].华南师范大学学报:自然科学版，2014，(3):10-17.

[3]Merchant M E，ThibodeauxD，LoubserK，et al.Antibacterial effects of serum from the American alligator(Alligator miss issippiensis)[J].Journal of Parasitology，2004，90(6):1480-1483.

[4]赓迪，段玉龙，徐晓琳，等.人工养殖暹罗鳄血体内、外抗肿瘤活性研究[J].中药材，2012，35(12):1901-1904.

[5]黄和平，陈孙福，罗永康.鳄鱼血蛋白酶解产物抗氧化特性和血管紧张素转化酶抑制活性研究[J].渔业现代化，2014，41(5):44-48.

[6]肖琨，王锡昌.养殖鳄鱼的营养价值和药用功能研究进展[J].食品工业科技，2014，35(11):355-358.

[7]陈弘培，赵慧，董诗婷，等.鳄鱼综合加工与高值化利用研究进展[J].农产品加工，2017，(20):62-67.

[8]Reed，L.J.，&Muench H.A simple method of estimating fifty per cent endpoints[J].Am.j.hyg，1938，27(3):493-497

[9]薛飞.暹罗鳄人工驯养技术初探[J].养殖与饲料，2016，(3):17-18.

[10]陈海艳，张鼎华.浅谈鳄鱼养殖技术及前景分析[J].水产养殖，2011，32(12):10-14.

[11]许东晖，马海萍，梅雪婷，等.鳄鱼的活性物质及其药理作用、保健功效研究进展[J].中国海洋药物，2007，26(6):44-47.

[12]Siddiqui R，JeyamoganS，Ali S M，et al.Crocodiles and alligators:Antiamoebic and antitumor compounds of crocodiles.[J].Experimental Parasitology，2017，183:194-200.

[13]崔小冬，欧阳召，王春梅，等.人工养殖暹罗鳄血清血浆及白细胞提取物体外抗菌活性研究[J].天然产物研究与开发，2012，(12):101-104.

[14]Merchant M E，PallanschM，Paulman R L，et al.Antiviral activity of serum from the American alligator(Alligator mississippiensis)[J].Antiviral Research，2005，66(1):35.