加米霉素注射液特殊安全性试验研究

张云茜，邓 菲，路美玉

(华北制药集团动物保健品有限责任公司，石家庄050041)

加米霉素注射液属动物专用大环内酯类半合成抗生素，已上市产品为法国梅里亚公司的Zactran。主要作用于溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌等引起牛呼吸道疾病的病原菌[1]。此外，对牛传染性胸膜肺炎的病原体-丝状支原体丝状亚种[2]、马链球菌兽疫亚种和对大环内酯类耐药和敏感的马红球菌[3]以及猪肺炎支原体和胸膜肺炎放线杆菌[4]均具有较好的体外抗菌活性。由于加米霉素在靶组织中有较高的活性浓度，对呼吸系统疾病病原菌药效迅速且持久[5]，具有抗菌谱广、抗菌活性强、动物专用、单次给药、吸收迅速、生物利用度高、低残留、安全高效等优点，故在动物呼吸道感染性疾病防治中具有广阔的应用前景[6-8]。我国已批准进口该药[9]，根据农业部公告要求，在国内生产此产品，须进行特殊安全性试验[10]。鉴于国内当前没有加米霉素注射液临床使用有关全部特殊安全性方面的资料，本研究旨在通过豚鼠、大白兔的皮肤致敏、皮肤刺激、局部刺激、红细胞溶血试验，全面考察加米霉素注射液的特殊安全性，从而为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 受试药物 加米霉素注射液，150 mg/mL，由华北制药集团动物保健品有限责任公司提供，批号：GMM03-1-GMM1。阳性对照药物：2，4-二硝基氯苯(含量99%)，购自sigma 公司。

1.2 试验动物 新西兰大白兔(体重2.5～3 kg)34只，雌雄各半，单笼、常规饲料喂养，自由饮水，由北京市海淀兴隆实验动物养殖厂提供，动物质量合格证编号为：NO.1180 5800001198；豚鼠系Hartley种白化豚鼠40只(一级，体重260～320 g)，雌雄各半，常规饲料喂养，自由饮水，由北京市海淀兴旺动物养殖场提供，动物生产许可证编号：SCXK(京)2016-0003。

1.3 试验方法及判定原则

1.3.1 皮肤刺激试验 采用新西兰大白兔进行，分组及剂量见表1。取加米霉素注射剂，直接涂布于左侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布(2.5 cm×2.5 cm)和一层无刺激塑料膜覆盖，再用无刺激胶布固定，家兔的右侧去毛皮肤涂布赋形剂(生理盐水)作对照。贴敷4 h后，除去受试物并用温水清洁给药部位。每天一次，连续7 d，每次给药时间相同。

每次去除药物后1 h以及再次贴敷前观察去毛部位皮肤是否有红斑、水肿及其他异常表现，并在末次给药后1、24、48、72 h肉眼观察去毛部位皮肤局部反应，按照《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[11](以下简称《原则》)进行刺激反应评分。以受试动物评分积分的平均值进行综合评价,最高积分均值﹤0.50，无刺激性；0.50～2.99，轻度刺激性；3.00～5.99中度刺激性；6.00～8.00强刺激性。

表1 皮肤刺激试验分组、剂量Tab 1 Test group and dose of skin irrigation response

1.3.2 皮肤致敏试验 采用白化豚鼠进行，分组及剂量见表2，以豚鼠背部左侧皮肤进行染毒。先进行诱导接触，分别在试验0、7、14 d时，在试验组豚鼠左侧备皮处涂敷加米霉素注射液，在阳性对照组动物相同部位涂敷2，4-二硝基氯苯。末次诱导后14 d进行激发接触，实验组和阴性对照组涂敷加米霉素注射剂，阳性对照组动物涂敷2，4-二硝基氯苯。

激发接触实验染毒后24、48、72 h，根据《原则》评判是否出现皮肤致敏反应并判定致敏强度。

表2 皮肤致敏试验分组、剂量Tab 2 Test group and dose of skin sensitization response

1.3.3 肌肉刺激试验 采用新西兰大白兔进行，分组及剂量见表3。试验前24 h剪去两侧股四头肌部位的兔毛，碘酊和乙醇消毒后分别在右侧股四头肌注入受试药物，左侧股四头肌注入同样体积的灭菌0.9%氯化钠溶液作对照。

给予受试物后4、12、24、48 h观察皮肤表面的反应及变化情况。观察48 h后将家兔处死，剖开股四头肌，肉眼观察注射部位肌肉组织的药液吸收情况，检查注射局部是否产生刺激性反应；并将高、中、低剂量组和对照组各4只(雌雄各两只)注射部位肌肉进行病理学检验。根据《原则》进行刺激反应评分。

表3 肌肉刺激试验分组、剂量Tab 3 Test group and dose of muscle irritation response

1.3.4 溶血试验 试验动物为新西兰大白兔2只，采用体外试管法，即肉眼观察法进行，分组及剂量见表4。采心脏血50 mL，制成脱纤血液，处理后置 37±0.5 ℃的恒温箱中进行温育。15 min、1 h、2 h、3 h各观察1次，若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，进一步判定是真凝聚还是假凝聚。

2 结果及分析

2.1 皮肤刺激试验 8只受试新西兰大白兔连续给药7 d期间，在其去毛部位均未观察到皮肤红斑、水肿及其他异常表现，且在停药后观察期限内的各个时间点均未出现红斑和水肿等刺激反应，见图1；根据《原则》判定受试物加米霉素注射液各个时间点的刺激反应积分均值为0，与阴性对照组比较无显著差异, 详见表5，表明受试物加米霉素注射剂对新西兰大白兔无皮肤刺激性。

2.2 皮肤致敏试验 受试药物组和阴性对照组豚鼠的皮肤在激发给药24、48、72 h后，皮肤均未见红斑和水肿现象(图2)；根据《原则》判定受试药物组和阴性对照过敏反应率为0，而阳性对照组豚鼠均出现严重或中度红斑和水肿，过敏反应发生率为100%，详见表6。表明受试药物加米霉素注射剂对豚鼠皮肤进行诱导后不出现过敏反应，试验结果为阴性。

2.3 肌肉刺激试验 给予受试物后4、12、24、48 h均未观察到注射部位充血、瘙痒、起包。给予受试物后48 h处死各剂量组和对照组各4只(雌雄各两只)家兔，病理显示其组织注射部位血管未见出血、血栓、血管扩张充血、间质炎细胞浸润及血管壁周围组织坏死等异常改变,详见图3。判定各个时间点的刺激反应积分均值为0，与阴性对照组比较无显著差异，详见表7，由此表明受试物加米霉素注射剂对新西兰大白兔无皮肤刺激性。

表5 皮肤刺激分值Tab 5 Skin irritation score

赋形剂对照组(给药1 d) 受试药物组(给药1 d)Excipient Control group (medicated 1 d) Tested medicine group(medicated 1 d)

赋形剂对照组(停药后72h) 受试药物组(停药后72h)Excipient Control group (withdrawal after72 h) Tested medicine group(withdrawal after72 h)

受试药物组 阴性对照组 阳性对照组图2 豚鼠给药后72 h皮肤致敏结果Fig 2 Results of guinea pigs skin sensitization after administration 72 h

时间(Time)/h分组(Gruop)皮肤红斑分值(Skin erythema scores)皮肤水肿分值(Skin edema scores)012340123过敏率(Allergy rate)/%24 阳性(Positive)004600037100阴性(Negative)100000100000试验(Test)20000020000048 阳性(Positive)007300046100阴性(Negative)100000100000试验(Test)20000020000072 阳性(Positive)007210046100阴性(Negative)200000200000试验(Test)100000100000

对照组(给药前) 高剂量组(给药前)

对照组(给药后48 h) 高剂量组(给药后48 h)

对照组(剖检) 高剂量组(剖检)

对照组 高剂量组

剂量(Dose)动物编号(Animal No.)对照(Control)试验(Test)高(High dose)100200300400500600700800中(Medium dose)9001000110012001300140015001600低(Low dose)17001800190020002100220023002400

2.4 溶血试验 试验结果显示1～6号试管在3 h内红细胞全部下沉，上清液体均为澄明，溶液中未见有棕红色或红棕色絮状沉淀；7号试管有棕红色絮状沉淀，振摇后不分散，详见图4，将凝聚物滴加2滴 0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚物不被冲散。可判定受试药物及阴性对照未发生溶血和凝聚，阳性对照组发生溶血，表明加米霉素注射剂对兔红细胞无溶血和凝聚作用，可以注射使用。

3 结 论

药物特殊安全性试验是注射剂临床前安全性评价的重要组成部分，主要由体外溶血性试验、过敏性试验、局部刺激性试验等组成。任何一项试验结果出现阳性，则表明该药安全性评价不符合标准，不宜用于注射途径给药。国外对于加米霉素注射液特殊安全性的公开文献较少。但ZACTRAN在欧洲兽用药品委员会提交注册的评估报告[12-14]显示，在3只兔子的皮肤刺激性试验中，加米霉素会对皮肤造成轻微刺激，与本试验结果有差异。分析原因为试验用注射液在制备过程中采用了包膜缓释技术，改变药物释放过程，降低皮肤刺激度。同时本实验结果在药物的Ⅱ、Ⅲ期靶动物临床试验中得到验证，在牛、猪注射部位均未出现水肿等刺激反应。欧盟[12-14]及FDA[15-16]根据靶动物牛、猪的安全性试验判定，加米霉素注射液以6 mg/kg体重剂量注射安全可行。

温育15 min 温育3 h图4 新西兰大白兔红细胞溶血性结果Fig 4 Result of New Zealand white rabbits red blood cell hemolysis

本研究通过大白兔、豚鼠的皮肤致敏、皮肤刺激、局部刺激、红细胞溶血试验表明，加米霉素注射剂无皮肤刺激性、不出现过敏反应 (致敏率为0)、无肌肉刺激性、无溶血和凝聚作用，临床上可以肌肉注射使用。

大环内酯类药物广泛应用于人及动物临床，如泰拉霉素[17-18]、红霉素、阿奇霉素和替米考星等，具有优良的抗菌抗炎作用[19-20]。加米霉素注射液作为新一代动物专用药品，它的特殊安全性研究及使用推广在保障食品安全、降低人用抗生素耐药性上有重要意义。加米霉素注射液属化学药品二类新兽药，特殊安全性试验为新药注册的重要组成部分，2017年2月原研单位梅里亚有限公司已在我国进口注册该品种，本试验的研究对于抢占国内市场具有重要支持作用。

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