高效液相色谱法测定6种兽用中药散剂中的利福平

章安源，李有志，张志民，张传津，冯 涛，陈 玲，刘道中

(山东省兽药质量检验所；山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南250022)

2012年，我国发布了国家中长期动物疫病防治规划[1]。奶牛结核病计划至2020年全国7省达到维持或净化标准[2]。养殖过程中抗菌药物的广泛使用(甚至滥用)易造成动物源性细菌耐药性的出现，多重耐药菌便可以通过食物传播到人类，耐药基因可在人类、动物和环境之间进行传播[3]，威胁动物源性食品和公共卫生的安全。

我国农业部为大力打击非法添加违禁药物，已经版布的2448号公告制订了多种中兽药散剂非法添加解热镇痛、金刚烷胺类等化学药物检查方法[4]。但利福平是人用药，已发布的公告中尚不涉及利福平的检查，研究旨在建立一种简单、方便、适用的高效液相色谱法，对兽用中药散剂中违规添加利福平进行定性定量检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 高效液相色谱仪Waterse2695 (配二极管阵列检测器2998)；AE-240电子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)；KQ-250DB超声仪(昆山市超声仪有限公司)。

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品 利福平对照品来自中国食品药品检定研究院，批号130496-201703，含量98.8%。

1.2.2 阴性样品 麻黄鱼腥草散、鸡痢灵散、金花平喘散、定喘散、银翘散制备：按比例[5]称取药材，置粉碎机中粉碎,混合均匀后为阴性样品；四黄止痢颗粒由山东某企业提供，未检测出利福平的合格产品，作为阴性样品。

1.2.3 阳性添加样品 按照1.2.2项下方法处理后阴性样品添加利福平对照品，混匀。

1.2.4 试剂 甲醇、乙腈，为色谱纯，德国Merck公司；磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液为0.04 mol/L 磷酸二氢钾溶液[6]。

1.3 检测方法

1.3.1 高效液相色谱条件 色谱柱为waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相为乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液(35∶35∶30)；检测器为二极管阵列检测器；采集波长范围200～400 nm，分辨率1.2 nm；记录237 nm波长处的色谱图、光谱图中纯度角度、纯度阈值及PDA/FLR 匹配1角度、PDA/FLR匹配1阈值；流速1.0 mL/min，柱温为30 ℃；进样体积为10 μL。

1.3.2 阴性样品溶液的制备 按1.2.2方法将处理后的样品各称取1.0 g置锥形瓶中，加入流动相50 mL，超声处理20 min，静置，滤过，取续滤液1.0 mL，加流动相定容至100 mL容量瓶中，用0.22 μm滤膜过滤，取滤液上机。

1.3.3 阳性样品溶液的制备 按1.3.2方法制备的阴性样品中每1 mL添加0.1 mg利福平，混匀作为阳性添加样品。

1.3.4 对照品溶液的配制 精密称取利福平对照品100 mg(精确到0.1 mg)加流动相定量稀释成每1 mL含100 μg溶液(临用前避光配制)[7]，用0.22 μm滤膜过滤，取滤液上机。

2 结 果

2.1 专属性试验 照1.3.1项下条件，精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液、阳性样品溶液各10 μL注入液相色谱仪。对照品溶液237 nm处有最大吸收波长(图1)保留时间约为6.953 min的峰(图2)。阳性样品溶液色谱图中的利福平峰(图3～图14)与对照品出峰时间一致。

图1 对照品溶液(100 μg/mL)光谱图Fig 1 Ultra-violet spectra of reference substance

图2 对照品溶液色谱图(100 μg/mL)Fig 2 The chromatogram of reference substance

图3 麻黄鱼腥草散阴性样品溶液Fig 3 The chromatogram of negative sample of Manghuangyuxingcao San

图4 麻黄鱼腥草散阳性样品溶液Fig 4 The spiked sample of Manghuangyuxingcao San

图5 鸡痢灵散阴性样品溶液Fig 5 The cromatogram of negative sample Jililing San

图6 鸡痢灵散阳性样品溶液Fig 6 The spiked sampleof Jililing San

图7 定喘散阴性样品溶液Fig 7 The chromatogram of negative sample of Dingchuan San

图8 定喘散阳性样品溶液Fig 8 The spiked sample of Dingchuan San

图9 银翘散阴性样品溶液Fig 9 The chromatogram of negative sample of Yinqiao San

图10 银翘散阳性样品溶液Fig 10 The spiked sample of Yinqiao San

图11 金花平喘散阴性样品溶液Fig 11 The chromatogram of negative sample of Jinhuapingchuan San

图12 金花平喘散阳性样品溶液Fig 12 The spiked sample of Jinhuapingchuan San

图13 四黄止痢颗粒阴性样品溶液Fig 13 The chromatogram of negative sample of Sihuangzhili kel

图14 四黄止痢颗粒阳性样品溶液Fig 14 The spiked sample of Sihuangzhili keli

2.2 峰纯度及光谱匹配检查图 建立对照品溶液中利福平峰的光谱库，对阳性样品溶液和对照品溶液中保留时间约为6.93 min的峰进行峰纯度检查，纯度角度小于纯度阈值(图15,图17)；PDA/FLR匹配1角度小于PDA/FLR匹配1阈值(图16,图18)。

图15 利福平峰纯度图Fig 15 The peak purity test of the reference substance

图16 利福平光谱匹配图Fig 16 Matching angle and threshold in the reference substance

图17 麻黄鱼腥草散中阳性样品中福平峰纯度图Fig 17 The peak purity test of the spiked sample of Manghuangyuxingcao San

图18 麻黄鱼腥草散阳性样品中利福平峰匹配图Fig 18 Matching angle and threshold in the spiked sample of Manghuangyuxingcao San

2.3 检测限试验 取1.3.4项下储备液，分别配制浓度为500、50、25、10、5、0.5 μg/mL的溶液，进行测定，同时记录色谱图与光谱图，得出光谱图失真浓度是0.5 μg/mL，故为方法检出限浓度。

2.4 线性关系考察 精密量取利福平对照品贮备液，用流动相逐级稀释成5、10、25、50、100、250 μg/mL的系列溶液，注入液相色谱仪，按照1.3.1条件下测定，按利福平面积与对应的浓度做标准曲线，并计算回归方程和相关系数(R2)，回归方程为：y=22404x-5001.4(r2=0.9997)。结果表明，利福平在5～250 μg/mL的浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取0.10 mg/mL的利福平对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，在1.3.1条件下进行测定，连续测定6次，峰面积RSD为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同批四黄止痢颗粒(批号为20170101，标识生产单位为山东某生物科技有限公司)，按1.3.2项下制备6份样品溶液，分别注入液相色谱仪，在1.3.1项下测定含量，RSD为0.5%，表明重复性好。

2.7 回收率试验 按1.3.3项下方法制备阳性添加样品，每种样品各平行6份，制备成样品溶液后，按照外标法定量，分别注入液相色谱仪，在1.3.1条件下进行测定，利福平平均回收率为92.9%～93.7%之间，RSD在0.4%～1.13%之间，显示该方法回收率较好，准确度较高。结果见表1。

2.8 耐用性试验 从柱温、流动相、色谱柱三个方面考察方法的耐用性。分别改变柱温为25 ℃、30 ℃、35 ℃；调整流动相中弱酸缓冲液浓度及比例,使用不同品牌、不同型号的色谱柱：Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)； Agilent Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)等，进样分析，考察色谱条件变动时该方法的耐用性。

2.8.1 稳定性试验 取同一对照品溶液，于制备后 0、2、4、6、12、24 h注入液相色谱仪，在1.3.1项下条件分别进行测定，利福平峰面积的RSD为0.2%，表明溶液在24 h内稳定。

2.8.2 判定依据 在相同条件下，在200～400 nm波长范围内供试品出现的色谱峰与对照品色谱峰保留时间相一致(差异小于等于±5%)；两者光谱图无明显差异(必要时可调整供试品溶液的浓度)；最大吸收处波长一致(差异小于等于±2 nm)，则判为检出被测试药物[4]。上述研究表明，6种阳性添加样品色谱图中出现未知峰与对照品出峰时间一致，吸光度一致；纯度角小于纯度阈值，PDA/FLR1匹配角1小于PDA/FLR1匹配1阈值，说明二者光谱均匀，未包裹共流出物，均为单一物质峰。故判定此阳性添加样品中出现的未知峰为利福平。

3 讨论与小结

3.1 波长、流动相的比例及柱温选择 利福平在237和334 nm有最大吸收，前者的吸收强度明显高于后者，故选择定量波长为237 nm。利福平为弱酸性药物，在相对弱酸环境下稳定[6,8]，试验中分别选用乙腈和甲醇溶解对照品，超声20 min后，对照品未完全溶解，可见异物。考虑到药物性质及吸光度的稳定性，采用弱酸性的流动相较乙腈和甲醇快速、完全溶解样品，故选择流动相提取和稀释样品。通过调整流动相中缓冲液浓度为0.04 mol/L磷酸二氢钾溶液(比例30%～40%)和0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(比例30%～40%)运行样品，其中，后者在运行低浓度样品时，利福平色谱峰易受到试剂峰或杂质峰的干扰，分离度较差，峰形较差，柱压高；而使用低比例30%，低浓度0.04 mol/L磷酸二氢钾溶液运行样品，分离效果好，峰形对称，保留时间适当，柱压稳定。故筛选乙腈∶甲醇∶浓度0.04 mol/L的磷酸二氢钾溶液(比例30%)=35∶35∶30作为试验流动相。相较之于25 ℃柱温，30 ℃柱温时系统柱压明显降低，峰形好，出峰时间稳定，35 ℃柱温与30 ℃柱温效果差别不大，30 ℃温度即可满足检测要求，故对柱温做具体规定调整到30 ℃。更换不同厂家的同类型色谱柱分别进行测定，出峰时间及峰型无明显差异，利福平含量的RSD为1.1%，表明色谱柱的微小变动对测量结果无明显影响。

表1 利福平添加回收率试验结果(n=6)Tab 1 The resultof the recovery rate of rifampicin

3.2 兽用中药散剂种类的选择及启示 中药属于天然药物，残留毒物量小，在现代养殖业预防和控制疾病发挥重要作用[9-11],散剂中的许多中药成分有抗感染、抗病毒，止痢的功效，添加利福平突出其止痢平喘抗感染功效。散剂性状是粉末状，与利福平易混匀，外观不易发现，故筛选本试验6种中兽医散剂作为阴性样品检测。

从筛选该批散剂的非法添加物到建立检测方法，对打击兽药处方外添加提供了一定的思路，提示兽药的非法添加不仅仅局限于兽用药，也有可能添加人用药物。目前，我国中兽药散剂中检测利福平的方法还没有完全建立，采用HPLC法建立了6种中兽药散剂中利福平的检测方法。该方法快速、简便、灵敏度高，为兽药行业健康发展大力推广使用的检测方法，有较好的实际应用价值。

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