猪伪狂犬病毒流行株JL1株主要基因的遗传变异分析

张姗姗，冷 雪，时 坤，李健明，宫庆龙，刘 艺，孙志博，刘亚东，杜 锐

(吉林农业大学,长春 130118)

猪伪狂犬病毒(Porcine Pseudorabies Virus，PRV)是猪伪狂犬病病原体[1]，可引起新生仔猪的致命感染、育肥猪呼吸道症状和母猪繁殖障碍，给养猪业造成严重经济影响[2]。PRV的一些主要糖蛋白参与病毒复制和传播，其中gE和gI基因是PRV增殖的非必需蛋白，同时具有协同控制毒力的功能，gE基因还可作为鉴别野毒感染和疫苗免疫的重要蛋白[3-5]。gD和gB糖蛋白是病毒复制所必需的糖蛋白，同时也是PRV重要的免疫原性蛋白，诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应[6-7]。TK基因(胸苷激酶)是PRV的非必需和主要的毒力基因，对病毒在中枢神经系统中的复制起重要作用[8]。

自2012年以来，中国许多Bartha-K61疫苗免疫猪场再次爆发猪伪狂犬病，特别是在猪群密集地区广泛传播。在我国多个省份的猪伪狂犬病疫苗免疫猪场的发病率和死亡率呈不断上升趋势，研究表明一些重要的糖蛋白在多个方面有一定程度的变异，出现了新的发病特征，存在毒力增强的情况，疫情更加难以控制，给养猪业构成了严重的经济负担。为了解吉林省某地区分离的PRV JL1株的遗传变异情况，对其主要基因进行克隆测序及遗传变异分析，以期为今后吉林省PRV新型疫苗的研制和猪伪狂犬病的预防和净化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与试剂 PRV JL1流行毒株，实验室保存；大肠杆菌JM109感受态细胞，pMD18-T Vector，Ex Taq DNA聚合酶，PrimeSTAR HS DNA Polymerase，Marker DL2000，250 bp DNA Ladder均购自TaKaRa公司；DNA Virus Kit购自OMGEA公司；凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Oxygen公司。

1.1.2 引物设计与合成 按照GenBank登录号为BK001744中的PRV TK、gD、gI、gE和gB全基因序列设计5对特异性引物(表1)，扩增目的片段大小分别为963、1101、1203、1734和2742 bp。引物均由库美生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Tab 1 The sequences of primers

1.2 方法

1.2.1 病毒基因组DNA提取及PCR扩增 按照OMGEA公司的Viral DNA Kit说明书提取DNA，并以提取的PRV基因组DNA为模板，对实验室保存的JL1毒株的TK、gI、gD、gE和gB基因分别进行PCR扩增，反应体系为：Ex Taq酶0.25 μL，GC bufferⅠ12.5 μL,dNTP 4 μL,DNA模板2 μL,上、下游引物各0.5 μL，DEPC水补足于25 μL。PrimeSTAR HS DNA Polymerase 25 μL,GC buffer 12.5 μL ,dNTP 2 μL,DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，DEPC水补足于25 μL。TK、gD、gI基因的PCR反应程序：95 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s，59 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。gE、gB基因PCR反应程序：98 ℃变性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 40 s/2 min 40 s，30个循环。反应结束，取3～5 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并观察其目的条带大小。将剩余PCR产物送生工生物公司进行测序鉴定。

1.2.2 目的基因克隆测序 用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段，并与pMD18-T克隆载体于16 ℃下连接过夜，次日转入大肠杆菌感受态细胞JM109中，涂布于含氨苄青霉素(终浓度为100 μL/mL)的LB平板上，37 ℃培养12～16 h。经蓝白斑筛选后，挑取单个菌落于6 mL含氨苄青霉素(终浓度为100 μL/mL)的LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min振荡培养12～16 h。经PCR鉴定正确的阳性质粒送上海生工生物公司进行测序。

1.2.3 遗传变异分析 利用DNASTAR MegAlign软件将PRV JL1毒株与GenBank数据库中具有代表性的参考毒株(表2)序列进行核苷酸及氨基酸同源性分析以及多序列比对分析，再利用Mega6.0软件的邻近法构建遗传进化树。

表2 序列分析用PRV参考毒株Tab 2 PRV reference strains for sequence analysis

2 结果与分析

2.1 PRV TK、gI、gD、gE和gB基因的PCR鉴定 以提取的PRV JL1株DNA为模板，使用TK、gI、gD、gE和gB基因特异性引物进行的PCR扩增，结果如图1所示，TK基因约963 bp、gI基因约1101 bp、gD基因约1203 bp、gE基因约1734 bp、gB基因约2742 bp，结果出现与目的条带预期结果一致的条带。

M1. Marker DL 2000；1-5. JL1株TK,gI,gD,gE和gB基因扩增产物; M2. 250 bp DNA LadderM. Marker DL 2000；1-5. TK,gI,gD,gE and gB gene PCR amplification product of JL1 strain; M2. 250 bp DNA Ladder图1 JL1株TK,gI,gD,gE和gB 基因PCR鉴定Fig 1 PCR amplification of PRV TK,gI,gD,gE and gB gene from JL1 strain

2.2 TK、gI、gD、gE和gB基因的序列分析

2.2.1 同源性分析 核苷酸和氨基酸同源性比对结果显示，JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因与2012年以后国内分离的流行毒株如BJ/YT、JS-2012、TJ、HeN1等PRV变异株的核苷酸同源性为99.7%～100%；其氨基酸同源性为99%～100%。与国内经典毒株(如Ea、Fa和SC)的核苷酸同源性为99.3%～100%；其氨基酸同源性为98.9%～100%。与国外毒株(如Bartha、Becker、Kaplan)的核苷酸同源性为96.4%～99.7%；其氨基酸同源性为94.3%～99.7%(表3-表7)。

结果表明，PRV JL1株与国内新流行变异毒株同源性较高, 与国内早期经典毒株次之, 而与国外经典毒株同源性较低。

表3 PRV JL1株TK基因的核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较Tab 3 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of TK gene of PRV JL1 strain

右上角为核苷酸的同源性比较，左下角为氨基酸同源性比较(表4-表7同)

表4 PRV JL1株gI基因的核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较Tab 4 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gI gene of PRV JL1 strain

表5 PRV JL1株gD基因的核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较Tab 5 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gD gene of PRV JL1 strain

表6 PRV JL1株gE基因的核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较Tab 6 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gE gene of PRV JL1 strain

表7 PRV JL1株gB基因的核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较Tab 7 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gB gene of PRV JL1 strain

续表

2.2.2 多序列比对分析 通过对JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因进行氨基酸多序列比对分析，结果显示，与国外经典毒株Kaplan比较,TK基因有1个氨基酸发生突变，与Bartha-K61相比有2个氨基酸发生突变，与国内近年来里流行株JS-2012株相比没有氨基酸发生突变，TK基因较为保守。与国外毒株Kaplan和Bartha比较,gD基因在第278位和279位插入两个氨基酸，即精氨酸(R)和脯氨酸(P),同时有8个氨基酸发生突变，与国内流行株JS-2012毒株具有相同的氨基酸插入和缺失。与国外经典毒株Kaplan比较，gI基因在第172位缺失一个组氨酸(H)，第238位插入一个甘氨酸(G)，gI基因这两处发生的缺失和插入与国内流行株JS-2012毒株相同，此外还发现19个氨基酸发生点突变。与国外经典毒株Kaplan比较，gE基因在第48位插入一个天冬氨酸(D),第496位插入一个天冬氨酸(D),gE基因这两处的插入与国内新流行株JS-2012株具有相同氨基酸插入，该位置发生的变异与国内报道的流行毒株变异特征相一致,此外还有16个氨基酸发生突变。与国外毒株Bartha、Kaplan相比,gB基因在第75～77位缺失3个氨基酸，即丝氨酸(S),脯氨酸(P)和甘氨酸(G),在第94位插入一个甘氨酸(G),gB基因这两处发生的缺失和插入与国内新流行株JS-2012毒株相同,另外在119～122位插入4个氨基酸(AAVR),gB基因该处发生的插入与德国分离的DUL34gfp毒株具有相同插入，此外还有20个氨基酸发生突变，该gB基因多处位置发生较大的变异，可能导致其抗原性发生变化。以上多序列比对结果表明，除去部分氨基酸变异，JL1株的变异与JS-2012株相同。

2.2.3 遗传进化分析 如图2所示，将JL1株TK、gI、gD、gE和gB主要基因与GeneBank上其他参考毒株进行遗传进化树分析，PRV根据不同国家分离的毒株可分为2个基因型，欧美毒株属于GⅠ型，而国内毒株属于GⅡ型。TK基因遗传进化树结果如图2A所示，PRV JL1毒株与中国新流行毒株处于一个分支(除了SC株)，尤以与LY、YY和BJ/YT新流行毒株遗传关系较近，而与国外欧美毒株遗传关系相对较远。gI基因遗传进化树结果如图2B所示，PRV JL1株与国内2012年分离的HeN1变异毒株处于一个相对独立的小分支，遗传关系较近，而与欧美毒株处于不同的分支，遗传关系相对较远。gD基因遗传进化树结果显示，欧美毒株中Becker和NIA3毒株又处于一个独立的小分支；中国毒株又可根据分离的年代不同分为A和B两个亚型，A型包括PRV JL1株和国内2012年以后分离的新型变异毒株，B型包括国内早期经典毒株；由图2C可见，JL1毒株与中国新流行变异毒株遗传关系较近，而与欧美毒株处于不同的分支，遗传关系相对较远。gE基因遗传进化树结果显示，国外毒株Becker和NIA3毒株又处于一个小分支；中国毒株又可根据其分离的年代不同分为A和B两个亚型，PRV JL1株与国内2012年以后分离的新型变异毒株属于A亚型，而国内早期经典毒株属于B亚型；由图2D可见，PRV JL1株与中国新流行毒株BJ/YT和TJ变异毒株遗传关系较近，而与欧美毒株处于不同的分支，遗传关系相对较远。gB基因遗传进化树结果显示如图2E所示，PRV JL1株与国内2012年以后分离的变异毒株遗传关系较近，而与欧美毒株处于不同的分支，遗传关系相对较远。

图2 JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因系统进化树分析图Fig 2 Phylogenetic tree analysis forTK(A),gI(B),gD(C),gE(D),gB(E) genes of PRV JL1 strain

3 讨 论

2012年以来，新型猪伪狂犬病已经发生在中国大部分Bartha-K61疫苗免疫猪场。由于新型的PRV变异株的出现导致中国猪场感染PRV局势日益恶化，对养猪业造成巨大的影响。研究报道[9-11]表明，这些新出现的PRV变异株的致病性高于以前PRV分离株，其免疫原性也不同于Bartha-K61疫苗，造成传统疫苗不能对变异株提供有效的免疫保护。不同毒株遗传进化分析表明，PRV可根据区域的不同划分为2种不同的基因类型，中国分离株属于基因II型，欧美国家分离株属于基因I型。这些新爆发的PRV变异毒株之间的亲缘关系较近而与欧美国家分离的Bartha株遗传关系较远，这可能也解释了PRV再次出现在Bartha-K61疫苗免疫猪场的原因。另外，中国近几年分离的PRV变异株与以前分离株相比，新流行毒株在基因和蛋白水平上发生了变异，进而导致现有疫苗保护率降低，疫病难以防控，这些基因变异可能也是导致传统猪伪狂犬病疫苗接种失败的一个关键因素。

为更好了解吉林省某地区PRV流行及遗传变异情况，对PRV JL1株TK、gD、gI、gE和gB基因进行了克隆测序，与Genbank上已发表参考毒株在核苷酸和氨基酸水平上进行同源性比对和多序列比对分析，并绘制了遗传进化树。其中核苷酸和氨基酸同源性比对表明，PRV JL1毒株与国内近几年新流行PRV毒株在核苷酸和氨基酸水平上同源性较高，而与国外经典毒株同源性较低。遗传进化树分析表明，PRV JL1株与中国近年来不同地区分离的新型PRV变异株遗传关系密切相关，而与国外经典毒株遗传关系较远，表明JL1毒株属于中国PRV新流行的变异毒株。氨基酸多序列比对表明，与GenBank中其他的参考毒株相比，PRV JL1毒株表现了广泛的变化，包括在大多数病毒蛋白发生替换、插入和或缺失。其gD基因在第278位和279位插入两个氨基酸(RP)，gI基因在第172位缺失一个组氨酸(H)和第238位插入一个甘氨酸(G)，gE基因在第48位和第496位各插入一个天冬氨酸(D)，gE基因该两处的插入为近几年PRV变异株特征变异位点，该位置发生的变异与国内范克伟[12]和Fan[13]报道的流行毒株变异特征相一致,这也表明该JL1毒株属于我国近几年的新流行毒株。gB基因在第75～77位缺失3个氨基酸(SPG)，第94位插入一个甘氨酸(G)，另外在119～122位插入4个氨基酸(AAVR)，gB基因该处发生的插入与德国分离的DUL34gfp毒株具有相同插入。因此，PRV JL1株重要基因的变异可能导致PRV毒力和抗原性发生变化。

总而言之，通过对PRV JL1毒株重要基因(TK、gI、gD、gE、gB)的遗传变异分析表明PRV JL1毒株不同于以前的分离株，具有PRV新流行变异株独特的变异特征。但这些氨基酸残基的变异对PRV变异株毒力及免疫原性的影响是否是导致中国近几年猪群PRV广泛流行的原因有待进一步研究。

参考文献：

[1] Klupp B G, Hengartner C J, Mettenleiter T C,etal. Complete, annotated sequence of the pseudorabies virus genome[J]. J Virol, 2004, 78: 424-440.

[2] Truszczyn'Ski M, Pejsak Z. Epizootic importance of the reservoir of Aujeszky's disease virus in feral swine and wild boars[J]. Journal of Mathematical Analysis & Applications, 2008, 357(2): 385-402.

[3] 杨涛涛, 赵 墩, 刘崇灵, 等. 湖南省4株伪狂犬病病毒的分离鉴定及其免疫与毒力相关基因的序列分析[J]. 中国畜牧兽医, 2016, 43(1): 50-57.

Yang T T, Zhao D, Liu C L,etal. Isolation and idengification of four strains of pseudorabies virus in Hunan province and sequence analysis of their related genes of immunity and virulence[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2016, 43(1): 50-57.

[4] 冷依伊, 任梅渗, 蒙正群, 等. 猪伪狂犬病病毒致病机理及其变异的研究进展[J]. 养猪, 2016, (5): 121-126.

Leng Y Y , Ren M S, Meng Z Q,etal. Progress in the pathogenesis and variation of the pseudorabies virus[J]. Swine Production, 2016, 5: 121-126.

[5] 孙佳楠, 王楠楠, 王 瑞, 等. 猪伪狂犬病病毒LN1301株分离鉴定及其gE和TK基因的变异分析[J]. 中国兽医学报, 2016, 36(8): 1324-1329.

Sun J N, Wang N N, Wang R,etal. Isolation and identification of porcine pseudorabies virus LN1301 strain and analysis of the variation of gE and TK genes[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2016, 36(8): 1324-1329.

[6] 祖立闯, 沈志强, 郭广君,等. 猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立[J]. 家畜生态学报, 2014, 35(1): 54-60.

Zu L C, Shen Z Q, Guo G J,etal. The expression of gD protein of porcine pseudorabies virus and eatablishment of a method for the detection of antibody against PPA-ELISA[J]. Acta Ecologica Animalis Domastici, 2014, 35(1): 54-60.

[7] 任卫科, 池晶晶, 李秀丽, 等. 伪狂犬病毒主要毒力基因的研究进展[J]. 畜牧兽医科学:电子版, 2017, (8): 12-13.

Ren W K, Chi J J, Li X L,etal. Process in research on the major virulene genes of pseudorabies[J].Graziery Veterinary Sciences, 2017, 8: 12-13.

[8] 樊振华, 孟 帆, 吴 忻, 等. 猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析[J]. .中国畜牧兽医,2014, 41(4): 12-17.

Fan Z H, Meng F, Wu X,etal. Sequence analysis of thymidine kinase gene of porcine pseudorabies virus strain Shanxi[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary, 2014, 41(4): 12-17.

[9] Wu R, Bai C, Sun J,etal. Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern China[J]. J Vet Sci, 2013, 14: 363-365.

[10] Luo Y, Li N, Cong X.,etal. Pathogenicity and genomic characterization of a pseudorabies virus variant isolated from Bartha-K61-vaccinated swine population in China[J]. Vet Microbiol, 2014, 174: 107-115.

[11] Yang Q Y, Sun Z, Tan F F,etal. Pathogenicity of a currently circulating Chinese variant pseudorabies virus in pigs[J]. World Journal of Virology, 2016, 5(1): 23.

[12] 范克伟, 戴爱玲, 李晓华, 等. 猪源伪狂犬病病毒福建龙岩分离株的鉴定及其TK基因和gE基因的分子特征[J]. 中国兽医科学, 2015, 10: 1021-1030.

Fan K W, Dai A L, Li X H,etal. Identification of porcine pseudorabies virus Fujian Lonyan isolate and its molecular characteristics of TK genes and gE gene[J].Chinese Veterinary Science, 2015, 10: 1021-1030.

[13] Fan J, Zeng X, Zhang G,etal. Molecular characterization and phylogenetic analysis of pseudorabies virus variants isolated from Guangdong province of southern China during 2013-2014[J]. Journal of Veterinary Science, 2016, 17(3): 369-375.