lncRNA CASC2c通过ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞SGC-7901增殖及迁移的影响

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003 1 消化内科； 2 中心实验室； 3 心脏超声科)

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是世界第二大死亡相关肿瘤[1-2]。胃癌是一种复杂的遗传性相关性疾病，已经证实了多种基因与胃癌的发生和发展有关，包括致癌基因或抑癌基因[3-4]。尽管最近在手术、放疗和化疗等治疗策略上取得了进展，但胃癌的预后仍然很差[5]。我国目前仍面临着早期胃癌检出率低的严峻挑战。因此，阐明胃癌发生的调控网络，发现新的诊断标志物以及开展新的靶向治疗方法显得至关重要。

长链非编码RNAs(lncRNAs)是长度大于200个核苷酸的但不编码蛋白质的一类RNA[6-9]。全基因组转录组研究(RNA测序、基因芯片与平铺阵列)已发现了数以千计的非编码RNA[10-11]。目前的研究已经证实lncRNAs可以参与许多重要的生物过程，如基因组印记[12]、染色体构象变化及酶活性的的变构调节等[13-14]。另外lncRNA的表达还可以调控细胞分化状态。更重要的是，lncRNA的过度表达或突变或缺失可以导致多种人类疾病的发生[15]。但是，目前对大多数lncRNAs的具体功能仍然是未知的，而且很多lncRNA可能并不存在实际的意义。lncRNA CASC2位于第10号染色体短臂26号位，是由BALDINU等[16]在子宫内膜癌中首次发现。BALDINU等[17]研究发现，CASC2通过可变性剪切形成3个转录变异体，分别为CASC2a、CASC2b和CASC2c。BALDINU等[17]研究还显示，CASC2a在子宫内膜癌中呈低水平表达，通过进一步的研究显示，CASC2a在子宫内膜癌中很可能发挥肿瘤抑制的作用。此外，HE等[6]发现CASC2a/b在非小细胞肺癌中也呈低水平表达，并且CASC2a/b表达水平的高低与非小细胞肺癌病人的预后相关。另外PEI等[18]研究显示，CASC2a/b在膀胱癌病人中表达水平明显降低，而升高CASC2a/b后可以抑制膀胱癌细胞的增殖。但是，目前很少有关于CASC2c对癌症的影响的研究，本实验通过筛选出与胃癌相关的lncRNA CASC2c，探讨CASC2c对胃癌增殖和迁移的影响，以及在胃癌发生发展中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料来源

选取2014年4月-2015年3月在我院确诊的胃癌病人的癌组织及相邻的正常组织标本36例。36例病人中男26例，女10例；年龄42～81岁，平均(60.3±9.8)岁。病人术前均未曾接受过辅助治疗。组织标本RNA提取后立即置于-80 ℃保存。病人同意参与本研究，取样过程在我院伦理委员会监督下进行。

1.2 细胞培养

胃癌细胞SGC-7901及正常人源胃细胞GSE-1细胞均购于美国细胞库(ATCC)。细胞培养液为含体积分数0.10的BI(Biological Industries, Cromwell, CT, USA)胎牛血清的DMEM混合培养液，细胞置于37 ℃，含体积分数0.05的CO2的培养箱中培养。

1.3 载体构建与转染

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)获取人源CASC2c序列。通过聚合酶链式反应(PCR)，采用HotStarTaq DNA聚合酶(QIAGEN, Valencia, CA, USA)扩增CASC2c完整序列。利用DNA连接酶将其插入载体质粒pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的KpnI和XbaI位点之间，以构建过表达载体pcDNA-CASC2c。引物序列如下：上游引物5′-CGGGGTACCCCGGGAGAACAGGATGGCCATGT-3′，下游引物5′-TGCTCT-AGAGCAGCCTTCTCCATGTTGGTCTC-3′。待细胞融合达到80%时使用转染试剂Lipofectamine 3000(Invitrogen公司，美国)转染过表达载体pcDNA-CASC2c。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测转染效率。

1.4 RT-qPCR检测胃癌组织及细胞系中CASC2c的表达

采用RNAiso Plus(TaKaRa, Shiga,Japan)分别提取实验组(胃癌组织及胃癌细胞SGC-7901)以及对照组(相邻正常胃组织和正常胃细胞GSE-1)中的总RNA，采用分光光度计检测RNA的浓度以及纯度。利用PrimeScript逆转录酶(TaKaRa, Shiga, Japan)将其逆转录成互补DNA(cDNA)。以cDNA为模板，按照SYBR GREEN EX TaqTM(TaKaRa, Shiga, Japan)说明书要求的反应体系和反应时间在LightCycler 480上进行RT-qPCR，所有实验结果重复3次，结果以2-△△CT计算并进行统计分析。实验以GAPDH作为内参基因。CASC2c上游引物：5′-TTCCTCTCCCCTTTGGACTT-3′，下游引物：5′-TCTGCTTCTGCTGCTGTTGT-3′；GAPDH上游引物：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.5 采用Western blot检测细胞中各蛋白的表达

用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解实验组SGC-7901细胞(转染pcDNA-CASC2c)和对照组SGC-7901细胞(转染pcDNA3.1)，裂解产物于100 ℃煮10 min，期间每隔3 min剧烈震荡裂解产物以打断DNA。使用BCA法进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳后以0.3 A恒定电流湿法转膜1.5 h，以50 g/L的脱脂牛奶室温封闭1 h。4 ℃一抗温育过夜，TBST洗3次，每次10 min。然后二抗室温孵育1 h。所需抗体为：Anti-p-ERK1/2、Anti-T-ERK1/2、Anti-β-catenin、Anti-GAPDH，均购自于CST(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)公司。蛋白条带使用vilber Lourmat(Eberhardzell, Germany)成像系统进行扫描分析。

1.6 采用CCK8实验检测细胞增殖能力

取生长状况良好的转染pcDNA-CASC2c的胃癌细胞SGC-7901(实验组)和转染pcDNA3.1的胃癌细胞SGC-7901(对照组)。细胞接种于96孔板(2 000个细胞/孔)，每组设置6个复孔，在37 ℃、含体积分数0.05的 CO2的培养箱中培养。每孔加入新鲜配制的无血清培养基110 μL(含10 μL CCK8检测液)，置于37 ℃培养箱中孵育30 min左右以后，用酶标仪检测细胞在450 nm波长处的吸光度(A)值，分别检测0、24、48、72以及96 h细胞增殖数目变化。

1.7 采用Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力

取生长状况良好的转染pcDNA-CASC2c的胃癌细胞SGC-7901(实验组)和转染pcDNA3.1的胃癌细胞SGC-7901(对照组)。细胞接种在装有小室的6孔板中，每组设置2个复孔。胃癌细胞SGC-7901悬浮在无血清培养基的上室(约100 000个细胞/孔)(8 μm孔径；BD Biosciences, San Jose, CA, USA)，下室为500 μL含体积分数0.10的胎牛血清的高糖DMEM培养液。24 h后，用棉签轻轻地拭去上室表面的细胞(即未侵入下室的细胞)，侵入下室的细胞采用甲醇固定，然后用结晶紫染色。在倒置显微镜下随机选取5个视野(包括膜的中央和周边)，计数侵入下室的细胞数目。

2 结 果

2.1 CASC2c在胃癌组织以及胃癌细胞中的表达比较

RT-qPCR检测结果显示，CASC2c在胃癌组织及相邻的正常胃组织中的相对表达量分别为1 510.371±1 311.034和3 769.740±3 023.203，两者比较差异有显著性(t=3.651，P<0.05)；CASC2c在胃癌细胞SGC-7901和正常胃细胞GSE-1中的相对表达量分别为0.240±0.110和1.170±0.150，两者比较差异有显著性(t=2.366，P<0.05)。

2.2 过表达CASC2c对胃癌细胞增殖以及迁移的影响

CCK8细胞增殖实验的结果显示，pcDNA-CASC2c诱导CASC2c高表达0、24、48、72及96 h后，实验组SGC-7901细胞在450 nm波长处的吸光度值分别为0.025±0.000，0.640±0.020，0.736±0.028，1.087±0.040，1.325±0.028；对照组SGC-7901细胞在450 nm波长处的吸光度值分别为0.025±0.000，0.733±0.140，0.861±0.030，1.317±0.061，1.536±0.045。与对照组比较，实验组SGC-7901细胞在24、48、72及96 h增殖能力降低，两组比较差异有显著性(t=3.283～18.910，P<0.05)。Transwell实验结果显示，实验组及对照组胃癌细胞SGC-7901穿过小室的数目分别为8.400±3.280和16.400±3.920，两组比较差异具有显著性(t=2.821，P<0.05)。

2.3 过表达CASC2c对p-ERK1/2和β-catenin表达量的影响

Western blot检测结果显示，与对照组相比，实验组p-ERK1/2及β-catenin的表达降低，两组比较差异具有显著性(t=8.538、5.667，P<0.05)；两组T-ERK1/2表达水平比较，两组比较差异无显著意义(t=2.718，P>0.05)。见图1，表1。

分组p-ERK1/2T-ERK1/2β-catenin对照组0.71±0.220.64±0.040.34±0.02实验组0.29±0.090.57±0.060.20±0.04

图1 不同处理组胃癌细胞SGC-7901中各种蛋白的表达

3 讨 论

越来越多的证据表明，lncRNAs在多种生物学过程中发挥着至关重要的作用[19]。相关功能研究表明，某些lncRNAs可以参与人类癌症的发生发展，并发挥癌基因或抑癌基因的作用。例如，MO等[20]研究显示，lncRNA XIST在胃癌组织和细胞系中高表达，并且可以促进癌细胞生长；而YUAN等[21]研究显示，lncRNA DANCR通过阻遏CTNNB1的表达从而起到抑制胃癌生长的作用。然而，由于lncRNA序列和空间结构的复杂性，更多的lncRNAs的功能、作用机制和临床意义尚不完全清楚，有待进一步的深入研究。

lncRNA CASC2通过可变性剪接从而产生CASC2a、CASC2b和CASC2c 3个转录体。以往的研究显示，CASC2a/b参与多种恶性肿瘤的发生以及发展过程，包括胃细胞癌和结直肠癌等，例如CASC2a/b可以作为内源性的RNA竞争性结合miR18a，抑制miR18a的表达，从而抑制结直肠癌细胞的增殖[22]。虽然CASC2c与CASC2a/b序列之间存在较大的差异，但是目前关于CASC2c对癌症影响的研究却鲜有报道。因此在本实验中，我们着重进行转录体CASC2c在胃癌发生、发展中的作用研究。

在本实验中，通过RT-qPCR检测已经证明CASC2c在胃癌组织及胃癌细胞中低表达，在一定程度上证明了CASC2c与胃癌病理过程的相关性。在此结果的基础上，我们继而研究了CASC2c对胃癌细胞生物学特性的影响及具体作用机制。利用CCK-8法检测胃癌细胞增殖能力，Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力。细胞学实验结果显示，CASC2c表达水平的升高可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖和迁移。细胞学实验进一步证明了CASC2c与胃癌的相关性，说明CASC2c在胃癌的病理过程中发挥抑癌基因的作用。在确定CASC2c对胃癌细胞生物学特性的影响之后，阐述这一影响的具体作用机制成为我们接下来的研究重点。大量的研究报道已经证实，诸多信号通路(如mTOR信号通路)在各种细胞事件中发挥着关键作用：包括调节基因表达、生长、代谢、凋亡和转移。本研究采用Western blot方法筛选CASC2c与信号通路之间的相互关联性。Western blot检测的结果显示，诱导CASC2c的表达后能够使p-ERK1/2和β-catenin的表达水平下调。p-ERK1/2和β-catenin分别为ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子，而ERK1/2表达水平降低表示ERK1/2信号通路处于失活状态。因此推测，CASC2c可能可以抑制ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路的活化。

综上所述，本研究结果显示，CASC2c在胃癌组织和胃癌细胞中低表达，过表达后可通过失活ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路而抑制胃癌细胞增殖和迁移，证实CASC2c对胃癌的发病具有抑制作用，此为胃癌早期诊断和治疗提供了新的思路。

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