纳米β-硅酸钙/硒的制备及其抗菌性能

刘玉昆，纪祥娟，梅 琳，崔 冉，周兴平，倪似愚

(1.东华大学 a.生态纺织教育部重点实验室; b.化学化工与生物工程学院，上海 201620; 2. 鲁南煤化工研究院，山东 济宁 272000)

近年来对于生物材料的研究表明，具备良好生物相容性和抗菌性能的多功能生物活性材料能更好地满足人体复杂生理环境的要求，研究开发具备抗菌性能的多功效生物活性材料具有现实意义和应用价值。β-硅酸钙(β-CaSiO3)是一种具有优良生物活性、较好生物相容性和良好生物矿化能力的生物陶瓷材料[1-3]。β-CaSiO3在骨修复和再生医学领域展现出广阔的应用前景并得到持续研究。其力学性能优于生物玻璃和羟基磷灰石[4-5]，而与磷酸钙[6-7]生物材料相比，β-CaSiO3因能够释放Si2+而具有骨诱导能力[8]。然而，β-CaSiO3本身的抗菌性能并不理想，可通过引入抗菌活性物质赋予其更加优良的抗菌活性[9]。

元素硒(Se)是人体的必需微量元素。零价态的红色纳米Se因其活性高、细胞毒性低[10]的特点而得到生物材料领域科研人员的密切关注[11]。近期研究表明，红色纳米Se具有良好的抗菌性能。Wang等[12]以谷胱甘肽为还原剂、亚硒酸钠为硒源在纸巾上制得纳米Se。抗菌试验表明，纳米Se对金黄色葡萄球菌(S.aureus)具有显著的抗菌作用。近期，Huang等[13]通过硼氢化钠还原亚硒酸钠制得纳米硒颗粒(Se-NPs)并测试其抗菌性能，结果表明Se-NPs对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)均表现出高效抗菌性能。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：油酸钙，硅酸钠，环己烷，亚硒酸钠，抗坏血酸，磷酸氢二钾，十二水合磷酸二氢钠，吐温-80，LB Broth，LB Broth Agar，无水乙醇。试验中所用去离子水为自制。

仪器：恒温磁力搅拌器(S21-1型)，高速离心机(Centrifuge 5810型)，马弗炉(KDFS70型)，全自动高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-S型)，双人超净工作台(SW-CJ-2FD型)，全温控制摇瓶柜(HYG-B型)，隔水式恒温培养箱(9080型)，X射线光电子能谱仪(AxisUltra DLD型)，X射线粉晶衍射光谱仪(D/max-2550PC型)，透射电子显微镜(HITACHI H-800型)。

1.2 纳米β-CaSiO3/Se的制备

(1) 称取3.015 g油酸钙加入盛有20 mL环己烷的三口烧瓶中，水浴加热至40 ℃，不断搅拌至油酸钙完全溶解后加入无水乙醇，搅拌10 min。

(2) 将1.421 g硅酸钠与20 mL去离子水的混合溶液加入上述三口烧瓶中，75 ℃水浴加热，回流反应2 h。

(3) 待上述反应完全并降至室温后，将0.5 g亚硒酸钠溶与10 mL去离子水的溶液加入三口烧瓶中，磁力搅拌10 min。随后滴加1 g抗坏血酸及10 mL 去离子水的混合溶液，溶液逐渐变为砖红色，室温下反应2 h。

(4) 反应完成后，分别用去离子水以及无水乙醇高速离心清洗，制得产物。随后以2 ℃/min的上升速率，分别在460 ℃以及800 ℃的马弗炉中煅烧2 h。

1.3 体外抗菌性能测试

试验菌种：大肠杆菌(ATCC 8099)，金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)。

(1) 菌悬液的制备。用接种环挑取菌种的单菌落于锥形瓶的灭菌液体培养基中，置于37 ℃、160 r/min 的摇床上振荡培养18 h，制得菌悬液。按照10倍梯度稀释法将上述菌悬液稀释100倍。

(2) 试样的制备。对照组为空白对照，直接加入95 mL的灭菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)，混合均匀后，再加入5 mL菌悬液，试验组为分别称取样品纳米β-CaSiO3、纳米β-CaSiO3/Se复合物0.5 g粉末放入三角烧瓶中，加入95 mL 的PBS，混合均匀后灭菌，再加入5 mL菌悬液。

(3) 振荡接触培养。将含对照样品和试验样品的三角烧瓶固定于恒温振荡培养箱的摇床上，37 ℃、150 r/min振荡培养，检查样品稀释后，振荡1～4 h。

(4) 振荡接触一定时间后活菌计数。振荡后的对照样品和试验样品经适当稀释后，分别取1 mL的样液接种于无菌的平面皿中，每个样液平行接种3个平皿，倾注45～55 ℃已融化灭菌的琼脂营养培养基，凝固后置于37 ℃的恒温培养箱中，24h后做菌落计数，平皿内菌落数乘以稀释倍数，即可求出试样培养皿内活菌数的平均值。试样的抑菌率计算如式(1)所示。

(1)

式中：Rab为抑菌率(%)；Ct为对照样品与细菌接触后表面黏附的平均活菌数(CFU);Tt为试验样品与细菌接触后表面黏附的平均活菌数(CFU)。

(5) 试验有效性判断。若对照样品与细菌接触24 h后，试样表面的活菌数在106CFU/mL以上，试验有效，否则视为无效重做全部试验。有效试验重复3次，每次试验每组样品5个试样，求平均值。

(6) 统计学分析。所有生物学试验数据均以平均数±标准偏差(SD)的形式表示，采用单因素方差分析进行统计分析，p<0.01视为具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 纳米β-CaSiO3/Se的EDS分析

为确定所制备样品的组分对其进行EDS测试，纳米β-CaSiO3/Se复合物的EDS图谱如图1所示。从图1可以看出，该样品主要含有Ca、Si、Se、O等元素，并且这4个元素的特征峰值较强，表明元素Se被成功引入纳米β-CaSiO3中。纳米β-CaSiO3/Se中各元素的原子百分比如表1所示。由表1可知，样品中Se的原子百分相比较理论值偏低，原因是单质Se熔点为217 ℃，在460 ℃煅烧过程中会有部分损失。

图1 纳米β-CaSiO3/Se复合物的EDS图谱Fig.1 EDS spectra of nano-β-CaSiO3/Se

表1 纳米β-CaSiO3/Se复合物中的主要元素组成Table 1 Elemental compositions of nano-β-CaSiO3/Se

2.2 纳米β-CaSiO3/Se的XRD分析

对试样进行XRD测试，进一步分析纳米β-CaSiO3/Se复合物中各组分晶型。不同煅烧温度下纳米β-CaSiO3/Se复合物XRD图谱如图2所示。图谱a为经过460 ℃煅烧后的样品，其衍射数据与JCPDS标准卡片No.73-0465的六方晶相硒的数据相符，表明经过460 ℃煅烧后的样品含有六方晶系的Se; 同JCPDS标准卡片No.84-0654的β-CaSiO3数据相符，可知样品中硅酸钙晶型为β-CaSiO3。经过800 ℃煅烧的样品XRD衍射图谱对比标准卡片同样表现出β-CaSiO3的特征峰，然而没有出现单质Se的特征峰。这主要是因为单质Se的熔点是217 ℃，所以经过800 ℃高温煅烧后，样品内不含有单质Se。

图2 不同煅烧温度下的纳米β-CaSiO3/Se复合物XRD图谱Fig.2 XRD spectra of nano-β-CaSiO3/Se with different sintering temperature

2.3 纳米β-CaSiO3/Se的TEM分析

使用TEM观察纳米β-CaSiO3/Se的复合物(460 ℃煅烧)的微观形貌，结果如图3所示。由图3可以直观地看到，该纳米β-CaSiO3/Se样品在溶液中的分散性较好，样品的颗粒直径较为均匀，颗粒直径分布范围为112～341 nm。

图3 纳米β-CaSiO3/Se复合物(460 ℃煅烧)的TEM图Fig.3 TEM images of nano-β-CaSiO3/Se with sintering temperature of 460 ℃

2.4 纳米β-CaSiO3/Se的体外抗菌性能测试

为准确测定纳米β-CaSiO3/Se的抗菌性能，对纳米β-CaSiO3和纳米β-CaSiO3/Se的抗菌性能分别做出定性以及定量的分析。样品对E.coli和S.aureus的抗菌性能定性分析试验效果图如图4所示。由图4可知，与对照组相比，E.coli和S.aureus与纳米β-CaSiO3接触培养24h后菌落数量出现一定程度下降，纳米β-CaSiO3/Se组的E.coli和S.aureus数量明显减少。对样品抗菌性能定量分析的抑菌率结果统计图如图5所示。从图5可得出，纳米β-CaSiO3对E.coli和S.aureus的抑菌率分别为(38±3)%和(42±3)%，纳米β-CaSiO3/Se复合物对E.coli和S.aureus的抑菌率分别达到(92±4)%和(95±4)%。

上述试验结果表明，纳米β-CaSiO3抗菌性能极为有限，Se的加入可以显著提高β-CaSiO3的抗菌性能。

(a) E.coli空白对照

(b) E.coli β-CaSiO3

(c) E.coli β-CaSiO3/Se

(d) S.aureus空白对照

(e) S.aureus β-CaSiO3

(f) S.aureus β-CaSiO3/Se

图4E.coli和S.aureus与试样接触培养24h后的菌落数照片

Fig.4ThecolonynumberofE.coliandS.aureuscontactedwithspecimensafter24h

图5 E.coli和S.aureus与试样接触培养24 h后的抑菌率统计(*表示样品试验组与空白组之间有差异)(Mean±SD，n=5，** p<0.01)Fig.5 E. coli and S. aureus antibacterial activity of nano-β-CaSiO3 and nano-β-CaSiO3/Se (* indicates the difference between specimens and blank) (Mean±SD，n=5，** p<0.01)

3 结 语

本文在采用油水界面法合成纳米β-CaSiO3的基础上，运用氧化还原法将红色纳米Se引入纳米β-CaSiO3， 制备得到纳米β-CaSiO3/Se复合物。通过EDS分析表明，该复合物中主要元素为Ca、Si、O、Se，样品中Ca、Si、Se所占原子比为17.27∶17.13∶12.11。XRD分析证明纳米β-CaSiO3晶型以及六方晶型纳米Se的存在。通过TEM观察表明，纳米β-CaSiO3/Se样品在溶液中的分散性较好，样品的直径范围为112～341 nm。

纳米β-CaSiO3、纳米β-CaSiO3/Se复合物对E.coli和S.aureus的抗菌试验表明：纳米β-CaSiO3有一定的抗菌性，对E.coli和S.aureus的抑菌率分别为(38±3)%和(48±3)%；纳米β-CaSiO3/Se复合物具有优良的抗菌性能，对E.coli和S.aureus抑菌率分别为(92±4)%和(95±4)%。由此可知纳米Se的加入使得纳米β-CaSiO3的抗菌性能显著增强。

参 考 文 献

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