双壳贝类消化系统中微塑料的分离鉴定及应用研究
2018-05-30丁金凤李景喜孙承君何昌飞蒋凤华高丰蕾郑立
丁金凤 李景喜 孙承君 何昌飞 蒋凤华 高丰蕾 郑立
摘 要 通过比较10% KOH和30% H2O2消解体系,建立了分离贝类消化系统中微塑料的前处理技术,采用傅里叶变换显微红外光谱仪(μ-FT-IR)和体式显微镜实现了微塑料的定性与定量分析,并用于检测栉孔扇贝和紫贻贝中的微塑料。结果表明,10% KOH消解体系的消解效率较高,聚丙烯(Polypropylene,PP)、聚乙烯(Polyethylene,PE)、聚苯乙烯(Polystyrene,PS)和聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)加标回收率为96.7%~98.6%,方法精密度较好,相对标准偏差≤ 3.2%,能够满足检测要求。检测了青岛5个大型水产品市场采集的市售栉孔扇贝(50个)和紫贻贝(50个),以及野生紫贻贝(15个)中的微塑料,贝类中微塑料的个体检出率达80%以上,野生贝类中微塑料的个体检出率仅为40%。不同市区市售栉孔扇贝中微塑料平均丰度变化范围为5.2~19.4 个/个体和3.2~7.1 个/g(消化系统组织湿重),不同市区市售紫贻贝中微塑料平均丰度变化范围为1.9~9.6 个/个体和2.0~12.8 个/g,其中,市售紫贻贝中微塑料的平均丰度(1.9个/个体,3.17个/g)高于野生紫贻贝中微塑料的平均丰度(0.53 个/个体,2.0 个/g)。在贝类中分离到纤维、碎片和颗粒3种形状的微塑料,其中,纤维状微塑料的丰度最高且平均粒径最大。不同市区贝类消化系统中的微塑料随着粒径增大,数量呈递减的总体趋势,其中,小于500 μm的微塑料占微塑料总量的26%~84%。贝类中丰度最高的微塑料的聚合物成分是赛璐玢(Cellophane,CP),其次是聚丙烯(Polypropylene,PP)。本方法具有简单、高效、对样品中微塑料损害低等优点,适用于海产品中微塑料的检测分析。
关键词 微塑料;双壳贝类;消化系统;微塑料污染;红外光谱
1 引 言
塑料及其制品被人类广泛使用,它在给人类的生活和社会生产带来便利的同时,废弃塑料垃圾大量累积,也对环境造成了污染。据报道,全球每年生产的塑料超过3 亿吨,其中约有10%的塑料会通过河流输入等方式进入海洋[1],在物理、化学、生物等共同作用下[2],大片塑料被分解成较小的碎片,当形成粒径<5 mm的颗粒时,可称之为微塑料[3]。由于塑料的化学性质较为稳定,可在海里留存上百年甚至数千年[4]。微塑料具有颗粒比表面积大、疏水性强等特点,易吸附持久性有机物[5,6]及重金属[7]等污染物。微塑料在海洋中或漂浮于海水中,或沉降于海底成为沉积物的组分[8],吸附污染物的微塑料被浮游动物和底栖动物摄食后,对生物有直接的毒害作用,并且可通过食物链传递效应在生物体内富集[9~12]。在生物肠道条件下,微塑料吸附的污染物解吸速度比在单独的海水中高30 倍[13],因此,海洋环境中的微塑料最终可能会危及人类的健康。
双壳贝类是底栖滤食性生物的优势类群,经常被作为污染的指示生物,用于海洋环境监测; 同时,双壳贝类味道鲜美,是主要的海产品,贝类携带的微塑料极易进入人体内。尽管到目前為止,摄入的微塑料对生物和人体的影响尚不明确,但研究生物体内微塑料的分布情况对正确评价其影响有重要意义,因而调查监测市售贝类产品微塑料含量,保证海产品安全,具有一定的研究意义和实际价值。目前,国内已经有针对市售贝类整体软组织中微塑料含量的调查[14,15],但是探究多种贝类消化系统中微塑料含量的研究较少,且样品的处理方法还有待改进,而双壳贝类的消化系统组织是微塑料的高密度聚集区,因此检测双壳贝类消化系统中的微塑料可以反映整个贝类软组织中微塑料的含量,具有一定的科学意义。
生物样品中分离微塑料的关键在于有效的消解有机质,且不影响微塑料的定性与定量分析。目前,应用于生物样品预处理的方法主要有:酸性消解、碱性消解及酶消解[16]。酸性消解在消解生物样品的同时也会消解部分类型的微塑料[16],如van Cauwenberghe等[17]使用69% HNO3溶液分离贻贝体内的微塑料,检出微塑料的丰度仅有0.36 个/g,并且没有观察到纤维状的微塑料; Catarino等[18]发现使用HNO3溶液过夜消解后,尼龙纤维类的微塑料消失。碱性消解需控制合适的碱浓度,既能消解有机质,而且不影响微塑料的定性与定量分析,如Cole等[19]发现1 mol/L NaOH在室温条件下对海水中浮游生物的消解率可达90%,但当NaOH浓度达到10 mol/L时,会损坏部分微塑料。酶消解的成本较高,使用较少。分离收集的微塑料需进一步通过鉴定,以明确微塑料的成分。目前微塑料的鉴定方法有:高温裂解气相色谱/质谱法、拉曼光谱法、傅立叶变换红外光谱法。 前两种方法鉴定微塑料成分时,容易受到塑料添加剂以及其它污染物的影响,并且高温裂解气相色谱/质谱法进行微塑料鉴定分析时,会完全破坏样品,造成样品的不可回收。傅里叶变换红外光谱法是目前较为通用的方法,这种方法分析样品前只需将样品进行干燥处理[1]。
本研究选取青岛市5个大型水产品市场中的双壳贝类及黄岛区野生紫贻贝为调查对象,建立了分离贝类消化系统中微塑料的前处理技术,初步调研了市售栉孔扇贝(Chlamys farreri)和紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)消化系统中微塑料的累积情况,并与野生紫贻贝消化系统中的微塑料进行对比,为青岛沿岸水域的微塑料污染及生态风险方面的调查研究提供了一定的方法学参考以及环境评估信息。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Nicolet iN 10MX傅里叶变换显微红外光谱仪(Thermo公司); 尼康SMZ1270型体视显微镜(南京衡桥仪器有限公司);ZQLY-180S型振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司); FSH-2A可调高速匀浆机(金坛市城西峥嵘实验仪器厂); KQ-400KDE型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司); 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司); Milli-Q超纯水(18.2 MΩ cm)处理系统(美国Millipore公司); ME104/02型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。
PP、PE、PS、PVC微塑料标准品(粒径 50 μm,上海阳励机电科技有限公司); KOH、 30% H2O2(分析纯,国药集团化学试剂有限公司); 玻璃纤维素滤膜(Whatman GF/F)。
2.2 微塑料回收实验
为了考察方法的准确度,在实验室中分别取15个较肥和较瘦弱的紫贻贝的消化系统部分,匀浆混匀后作为消解基质,并以10% KOH溶液与30% H2O2溶液为消解体系, 对样品进行处理。选取粒径为50 μm的海洋环境中常见的4种材质的微塑料标准品(PP、PE、PS、PVC)进行加标回收实验,每组做3个重复,同时每个消解体系做3个空白对照。具体步骤如下:(1)准确称取0.50 g匀浆后的消化系统组织和0.1000 g微塑料标准品于250 mL锥形瓶中。 (2)每个锥形瓶中加入50 mL 10% KOH溶液或30% H2O2溶液后密封。(3)超声5 min完全混匀后,将锥形瓶放入60℃、90 r/min的振荡培养箱中消解有机质。(4)消解24 h后,立即将消解后的溶液抽滤至已称重的玻璃纤维滤膜上(直径为47 mm,孔径为0.7 μm)。(5)将滤膜暂放于玻璃培养皿中,于50℃的烘箱中干燥后称重,计算回收率。
2.3 双壳贝类样品采集及微塑料的分离
养殖的栉孔扇贝和紫贻贝购于青岛市区的5个大型水产品批发市场(2017年春季),野生紫贻贝采集于青岛市黄岛区的岩石海岸带(2017年春季)。生物样品采集完毕后,立即带回实验室,测量其体长、体重并记录,于20℃下冷冻保存至分析。
解剖取单个贝类消化系统部分,贝类的消化系统由消化道及消化腺组成,解剖时应避免误取其它组织。取出贝类消化系统组织称重后置于250 mL锥形瓶中,加入100 mL 10% KOH溶液后密封。超声5 min后,将锥形瓶置于振荡培养箱消解24 h。样品消解完成后,立即将消解后的溶液抽滤至玻璃纤维滤膜上。滤膜置于玻璃培养皿中,于50℃的烘箱中干燥待测。
每次实验时做一个空白对照, 以除去实验室环境对样品的沾污,实验过程中应避免接触纤维类以及塑料器材。另外,所有使用的玻璃容器均用超纯水冲洗3次。对于非使用中的样品及溶液,应覆盖避免沾污。
2.4 微塑料样品的定量与定性分析
将富集微塑料的滤膜放置在体视显微镜下对微塑料进行观察(放大20~80倍),将微塑料颗粒以及疑似为微塑料的颗粒进行记录,并用尼康Ds-Ri2照相系统拍摄微塑料照片。获得的微塑料及疑似微塑料的颗粒利用傅里叶变换显微红外光谱仪进行成分分析,确定聚合物的类型。红外光谱仪选用透射模式,光谱范围设定为4000~675 cm1,样品采集时间为3 s,每次测量共进行16次扫描,光谱分辨率设置为8 cm1。光阑大小视样品中微塑料的具体尺寸确定。最后,将微塑料光谱图与OMNIC picta软件中的谱库进行检索對比,结合官能团的特征峰以确定聚合物的类型。
3 结果与讨论
3.1 方法学考察结果
对10% KOH和30% H2O2溶液消解0.50 g消化系统组织的结果进行比较。结果表明,消解24 h后,10% KOH溶液可完全消解,溶液中无固体有机质的存在,剩余有机质的质量仅为0.0033 g,残余量为6.6‰; 30% H2O2溶液消解有机质24 h后,溶液中仍有少量白色固体有机质,剩余有机质的质量为0.0155 g,残余量为3.1%,两者在统计学分析上存在极显著差异(p<0.01)。
通过计算回收率发现,以10% KOH溶液为消解体系,PP、PE、PS和PVC标准品回收率的范围为96.7%~98.6%(PP>PE>PS>PVC); 以30% H2O2溶液为消解体系,PP、PE、PS和PVC标准品回收率的范围为93.7%~97.6%(PS>PP>PE>PVC)。不同消解体系,4种微塑料标准品的回收率均表现为10% KOH>30% H2O2,其中,PS标准品的回收率在两种消解体系中差异不明显。实验结果表明,以10% KOH溶液作为消解体系, 4种材质的微塑料回收精密度较好(RSD≤3.2%),说明测定结果具有良好的重现性和准确度。加标回收率及精密度实验结果见表1。
3.2 生物样品的形态学特征
测量了采集的贝类的壳长、带壳湿重以及消化系统组织的湿重,结果见表2。不同市区同一物种的形态学特征差距不明显,但同一市区不同物种形态学特征差距较大,其中,同一市区的贝类消化系统组织湿重的比较:市售栉孔扇贝>市售紫贻贝>野生紫贻贝。
3.3 生物中微塑料的含量及分布特征
3.3.1 贝类中的个体微塑料检出率 贝类(2种)消化系统中的微塑料检测结果显示(表2): S1和S5市售紫贻贝的个体微塑料检出率达到100%,其它3区均为90%; S1、S2及S4的市售栉孔扇贝的个体微塑料检出率为90%,而S3的个体微塑料检出率是100%,S5较其它地点低,个体微塑料检出率为80%。野生紫贻贝的个体微塑料检出率只有40%。由此可见,养殖贝类中的个体微塑料检出率高于野生贝类中的个体微塑料检出率。
3.3.2 贝类中微塑料的丰度分布 在贝类样品中,市售栉孔扇贝消化系统中微塑料的平均丰度为5.2~19.4个/个体和3.2~7.1个/g,市售紫贻贝的平均丰度范围为1.9~9.6个/个体和2.0~12.8 个/g (图1),与Li等[15]检测的紫贻贝整个软组织中的微塑料平均丰度相差不大。其中,S1的紫贻贝消化系统组织中微塑料的平均丰度(9.6个/个体,12.8 个/g)在5个市区的紫贻贝中均表现为最高,这与贝类生长区环境污染严重密切相关。本研究为了排除空气中微塑料的污染,每次实验设置一组空白对照,结果表明,空白组的微塑料含量只有(0.67±0.58)个/滤膜,并且在统计结果中均已扣除了背景值。
本研究发现,市售紫贻贝消化系统中微塑料的平均丰度(1.9个/个体,3.17 个/g)高于野生紫贻贝消化系统中微塑料的平均丰度(0.53个/个体,2.0个/g),两者体内微塑料积累量差异显著,这与Mathalon等的研究结果一致[20]。这可能与养殖紫贻贝附着在聚丙烯塑料线上生长有关,养殖水域内可能含有较短、老化的聚丙烯塑料线,增加了养殖紫贻贝误食的几率。而Li等[15]的研究指出野生紫贻贝体内微塑料的含量高于养殖紫贻贝体内微塑料的含量。文献[21,22]的结果表明, 养殖紫贻贝与野生紫贻贝体内微塑料含量差异不明显。可见,不同地区紫贻贝中微塑料含量差异大,这可能与不同地区受微塑料污染的程度大小相关。
3.3.3 贝类中不同形状微塑料的含量 贝类样品中存在纤维、碎片和颗粒3种不同形状的微塑料,其含量高低顺序为纤维状>碎片状>颗粒状,分别占微塑料总数的84.11%、14.94%和0.95%。其中,颗粒状微塑料仅在S3和S5市售栉孔扇贝中检出,且数量较少,S2和S3市售紫贻贝中检出碎片状的微塑料数量较其它市区偏高(表3)。由此说明,不同市区的微塑料污染情况具有较大的空间差异性。
3.4 贝类中微塑料的颜色及粒径特征
3.4.1 贝类中微塑料的颜色特征 贝类样品中检出的微塑料有多种颜色。其中,纤维状的多为黑色和蓝色,也有少量为绿色(图2A~2C)。碎片状的微塑料以透明和红色为主(图2D~2F); 颗粒类的微塑料多为白色的小球(图2G)。
3.4.2 贝类中微塑料的粒径特征 贝类消化系统中检出的微塑料的粒径范围是在25 μm~5 mm。其中,粒径小于500 μm的微塑料占26%~84%, 500~1000 μm之间的微塑料占13%~53%,>1 mm的微塑料占3%~42%(图3)。不同市区贝类中的微塑料随着粒径增大,数量呈现递减的总体趋势。
本实验中在测量不同形状微塑料的粒径时,纤维状的微塑料是对其实际长度进行的测量,碎片状和颗粒状的微塑料则通过测量其最长长度作为微塑料的粒径。通过统计发现,不同形状的微塑料粒径分布也有所差异。纤维状微塑料的平均粒径最大,达到(0.66±0.70) mm; 其次是碎片状微塑料,平均粒径为(0.39±0.50) mm; 颗粒状微塑料的平均粒径最小,为(0.25±0.11)mm(图4A)。另外,不同市区的纤维状微塑料的平均粒径均最大,碎片状微塑料的平均粒径空间差异性较大(图4B)。可见,微塑料粒径的大小差距较大且受空间差异的影响,可能与贝类生长区塑料不同的碎化程度有关。
3.5 贝类中微塑料的聚合物类型
通过μ-FT-IR 鉴定贝类中微塑料聚合物的成分,发现贝类中丰度最高的微塑料成分是赛璐玢(CP)(图5A),其次是聚丙烯(PP)(图5B)、聚四氟乙烯(PTFE)等。样品中大部分纤维状的微塑料为赛璐玢,少量碎片状的微塑料也为赛璐玢。赛璐玢是一种再生纤维素薄膜,具有较低的生物降解性。许多塑料被貼上“可生物降解”的标签,但只有温度达到50℃才会完全分解,可生物降解塑料似乎是解决海洋塑料垃圾问题的“虚假解决方案”[23]。文献[23~25]中均将赛璐玢定义为微塑料。本研究也将赛璐玢认定为微塑料。另外,本研究在养殖紫贻贝消化系统中检测出聚丙烯塑料线,而在野生紫贻贝消化系统中检出的微塑料多为纤维状的赛璐玢。由此说明,养殖与野生贝类体内的微塑料含量与其所在的环境密切相关,可通过检测贝类体内微塑料的类型,侧面评估养殖水域的微塑料污染情况。
4 结 论
采用KOH消解体系对贝类消化系统组织进行消解,不但消解彻底、节省了样品前处理时间,而且加标微塑料回收率高。结果表明,市售贝类消化系统中微塑料的丰度较高,并且微塑料的形状和粒径分布具有较大的空间差异性。另外,本研究发现市售贝类消化系统中微塑料的个体检出率高于野生贝类中的个体微塑料检出率,并且贝类消化系统中的微塑料的类型及含量与环境中的微塑料分布密切相关。本研究结果可为海洋环境微塑料污染状况评价及海产品安全控制等提供技术支撑。
References
1 SUN Cheng-Jun, JIANG Feng-Hua, LI Jing-Xi, ZHENG Li. Advances in Marine Science, 2016, 34(4): 450-461
孙承君, 蒋凤华, 李景喜, 郑 立. 海洋科学进展, 2016, 34(4): 450-461
2 Rochman C M, Mark Anthony B, Halpern B S, Hentschel B T, Hoh E, Karapanagioti H K, Rios-Mendoza L M, Teh S, Thompson R C. Nature, 2013, 494(7436): 169-171
3 Law K L, Thompson R C. Science, 2014, 345(6193): 144-145
4 Cóar A, Echevarría F, Gonzlez-Gordillo J I, Irigoien X, beda B, Hernández-León S, Palma T, Navarro S, García-de-Lomas J, Ruiz A, Fernndez-de-Puelles M L, Duarte C M. Proc. Natl. Acad. Sci., 2014, 111(28): 10239-10244
5 Antunes J C, Frias J G L, Micaelo A C, Sobral P. Estuar. Coast. Shelf. Sci., 2013, 130: 62-69
6 Oliveira M, Ribeiro A, Hylland K, Guilhermino L. Ecol. Indic., 2013, 34: 641-647
7 Ashton K, Holmes L, Turner A. Mar. Pollut. Bull., 2010, 60: 2050-2055
8 ZHAO Shu-Jiang, WANG Hai-Yan, LIU Jian. Marine Sciences, 2009, 33(3): 84-86
赵淑江, 王海雁, 刘 健. 海洋科学, 2009, 33(3): 84-86
9 LI Feng, DING Chang-Qing. Chinese Journal of Zoology, 2006, 41(2): 128-134
李 峰,丁長青. 动物学杂志, 2006, 41(2): 128-134
10 Rios L M, Moore C, Jones P R. Mar. Pollut. Bull., 2007, 54: 1230-1237
11 Tanaka K, Takada H, Yamashita R, Mizukawa K, Fukuwaka M, Watanuki Y, Guilhermino L. Mar. Pollut. Bull., 2013, 69: 219-222
12 Setl O, Fleming-Lehtinen V, Lehtiniemi M. Environ. Pollut., 2014, 185: 77-83
13 Bakir A, Rowland S J, Thompson R C. Environ. Pollut., 2014, 185: 16-23
14 Li J N, Yang D Q, Li L, Jabeen K, Shi H H. Environ. Pollut., 2015, 207: 190-195
15 Li J N, Qu X Y, Su L, Zhang W W, Yang D Q, Kolandhasamy P, Li D J, Shi H H. Environ. Pollut., 2016, 214: 177-184
16 WANG Kun, LIN Kun-De, YUAN Dong-Xing. Environmental Chemistry, 2017, 36(1): 27-36
王 昆, 林坤德, 袁东星. 环境化学, 2017, 36(1): 27-36
17 van Cauwenberghe L, Janssen C R. Environ. Pollut., 2014, 193: 65-70
18 Catarino A I, Thompson R, Sanderson W, Henry T B. Environ. Toxicol. Chem., 2017, 36: 947-951
19 Cole M, Webb H, Lindeque P K, Fileman E S, Halsband C, Galloway T S. Sci. Rep., 2014, 4: 4528
20 Mathalon A, Hill P. Mar. Pollut. Bull., 2014, 81: 69-79
21 de Witte B, Devriese L, Bekaert K, Hoffman S, Vandermeersch G, Cooreman K, Robbens J. Mar. Pollut. Bull., 2014, 85: 146-155
22 Vandermeersch G, Loureno H M, Alvarez-Munoz D, Cunha S, Diogène J, Cano-Sancho G, Sloth J J, Kwadijk C, Barcelo D, Allegaert W, Bekaert K, Fernandes J O, Marques A, Robbens J. Environ. Res., 2015, 143: 29-45
23 Su L, Xue Y G, Li L Y, Yang D Q, Kolandhasamy P, Li D J, Shi H H. Environ. Pollut., 2016, 216:711-719
24 Denuncio P, Bastida R, Dassis M, Giardino G, Gerpe M, Rodríguez D. Mar. Pollut. Bull., 2011, 62: 1836-1841
25 Yang D Q, Shi H H, Li L, Li J N, Jabeen K, Kolandhasamy P. Environ. Sci. Technol., 2015, 49: 13622-13627