过表达EuCuZnSOD提高巨尾桉的耐寒性研究

赵艳玲 韩瑶 靳玉蕾

摘 要：  铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）是一种清除超氧阴离子自由基的金属酶，与多种抗逆性相关。该研究利用CaMV35S启动子融合巨尾桉EuCuZnSOD1基因通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法导入巨尾桉中，经卡那霉素初步筛选和PCR鉴定，得到10株转基因阳性植株。结果表明：通过-13.1 ℃暗处理5 h的抗寒性实验，发现40和41号植株在低温下无叶片萎蔫现象，组培室培养100 d后全株存活无白化叶片，说明这两株转基因巨尾桉的抗低温和冻害后恢复能力较强。在4 ℃低温胁迫下跟踪监测转基因温室苗的SOD酶活性发现，与对照相比转基因植株的SOD酶比活力无规律性且变化不大，但是相同条件下实时定量PCR检测结果表明抗寒性较强的40和41号植株在常温下EuCuZnSOD1的表达量较对照增加了约9倍，4 ℃处理36 h后EuCuZnSOD1的表达量相比对照植株分别增加了16倍和36倍，说明EuCuZnSOD1在低温胁迫下的表达量增加提高了巨尾桉的耐寒性。分析轉基因组培苗全株的硫酸木质素含量，表明EuCuZnSOD1高表达不影响甚至降低了巨尾桉的木质素含量，40号植株的木质素含量与对照相同，而41号整株植株的木质素含量相比对照降低了56%，其他检测转基因植株的木质素含量均有不同程度的降低。该研究结果表明巨尾桉中大量表达EuCuZnSOD1基因可以提高巨尾桉的抗寒能力以及寒害后的恢复能力，不影响甚至可能是负调控了转基因巨尾桉的木质素生物合成。

关键词： 巨尾桉， 铜锌超氧化物歧化酶， 转基因， 抗寒性， 硫酸木质素

中图分类号：  Q945.78

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2018）01-0101-08

Over-expression of cytosolic copper/zinc superoxide dismutase gene and increase cold-tolerance in Eucalyptus grandis × E. ophylla

ZHAO Yanling， HAN Yao， JIN Yulei

（ College of Chemical Engineering， Huaqiao University， Xiamen 361021， Fujian， China ）

Abstract：  Copper/zinc superoxide dismutases are important antioxidant enzymes to guard cells against superoxide toxicity. The over-expression of CuZnSOD can improve the resistance and recovery ability of plants to abiotic stresses such as salt， drought， cold and high temperature stress. The plant genome encodes three types of CuZnSOD， the CuZnSOD1 in cytoplasm， the CuZnSOD2 in chloroplast and the CuZnSOD3 in peroxisome or extracellular. The cytosolic EuCuZnSOD1 gene was cloned from Eucalyptus grandis × E. ophylla （GenBank Accession Number： JX138573） and the biological function was verified by prokaryotic expression system. The fusion vector of sense EuCuZnSOD1 gene derived by CaMV35S promoter was constructed and transformed to Eucalyptus grandis × E. ophylla by Agrobacterium. Using Kanamycin selection and PCR analysis， ten transgenic eucalyptus lines were obtained. Compared with the control plants the tissue culture transgenic eucalyptus No. 40 and No. 41 could be well tolerant in -13.1 ℃ for 5 h and recovery without obvious damage. There was no distinct increase in SOD enzyme activity in transgenic plant paralleled with wild plant under room temperature and 4 ℃ for 48 h. However， the real-time PCR analysis showed that the expression of  EuCuZnSOD1 was raised to about nine times higher than wild line under room temperature. After 4 ℃ for 36 h， the expression of EuCuZnSOD1 in No. 40 and No. 41 line was respectively increased about 16 and 36 times higher than the wild plant and then down to the normal level at 4 ℃ for 48 h. The data indicated that the increased expression of EuCuZnSOD1 improves the cold tolerance of Eucalyptus. The klason lignin content of transgenic Eucalyptus was reduced especially the No. 41 Eucalyptus was decreased to 56% of the control plant except for the No. 40 plant was no significantly different from the control plant. In conclusion， over-expression of the cytosolic EuCuZnSOD1 in Eucalyptus grandis × E. ophylla could enhance the cold-tolerance and improve the recovery ablity.

Key words： Eucalyptus grandis × E. ophylla， copper/zinc-superoxide dismutases， transgenosis， cold-tolerance， klason lignin

桉树是世界三大用材树种之一，其种植面积已经占世界人工林面积的三分之一，是一种极具价值的经济林。但是，低温、其它环境胁迫、人工除草等高成本因素严重影响了桉树人工林的发展，而选育良种、培育新品种则是解决这一问题的有效途径。基因工程育种具有高效性和目标性强等特点，可以加速优质、高抗桉树新品种的选育进程。目前，已经有澳大利亚、日本、巴西和中国等获得了转基因桉树。

目前，桉树抗寒分子机理研究较少，主要集中在抗寒轉录因子CBF的功能研究，首先，法国图卢兹大学的Teulieres课题组克隆了巨桉的CBF基因（Kayal et al，2006），研究了CBF基因与抗寒性的关系（Navarro et al，2009），将巨桉CBF1基因转入杂交桉树中发现转基因桉树除了抗寒能力增强之外，还表现出生长缓慢、保水能力增强等常青阔叶树所具备的生理特点（Navarro et al，2011）;随后分析了AP2/ERF基因家族的功能，发现DREB1/CBF与桉树的寒害逆境相关（Cao et al，2015），后通过高通量的qPCR技术研究了巨桉的CBF和DREB2与桉树冷、热和干旱逆境的关系，发现CBF调节桉树的抗逆与生长（Nguyen et al，2017）。将巨桉的低温胁迫响应基因EgrCR（徐凤华等，2016）转化拟南芥，提高了拟南芥的抗冻性，证明了与桉树的抗寒性相关。此外，还开展了低温胁迫下的尾巨桉和邓恩桉转录组学研究（Liu et al，2014）和巨桉的茎在短时寒害下的蛋白质组学研究（Leonardi et al，2015）。

SOD活性可作为筛选桉树抗寒性的一个生理指标，研究发现不同种类的桉树应对低温逆境时其SOD的活性变化差异明显（刘友全等，2000）。例如尾巨桉和邓恩桉对低温具有不同的响应特性，低温胁迫下SOD的活性均有升高，且耐寒的邓恩桉的SOD活性高于尾巨桉（刘奕清，2015）。综上所述，研究表明SOD的活性与桉树对低温胁迫的抵抗能力成正相关。

本实验室成功克隆了巨尾桉的EuCuZnSOD基因（GenBank Accession Number： JX138573），通过原核表达，证明该基因具有生物学功能（赵艳玲和周利建，2015）。本研究通过基因工程手段获得过量表达EuCuZnSOD的巨尾桉转基因植株，研究超表达EuCuZnSOD与桉树抗寒能力的关系，为定向培育耐低温桉树新品种提供直接的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

EuCuZnSOD 为本研究实验室克隆并保存（GenBank Accession Number： JX138573）。巨尾桉无菌苗、pBI121载体、JM109菌株、农杆菌LBA4404为本实验室保存。PCR体系、内切酶等均购自Takara公司，其他试剂购自上海生工。引物由厦门精聚公司合成。

1.2 方法

1.2.1构建植物二元表达载体与农杆菌介导的叶盘法转基因桉树 pBI121和pMD-CSD质粒BamH I/Sac I双酶切，双酶切产物由TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收，T4 DNA ligase连接片段，双酶切验证和测序检测阳性克隆载体。将pBIEuCSD转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，参照（周利建和赵艳玲，2012）叶盘法转化巨尾桉，50 mg·L-1 Cef，5 mg·L-1 Kan，初步筛选转基因桉树。

1.2.2 转基因巨尾桉的PCR检测 CTAB法提取转基因桉树基因组DNA，引物1：5′-ATGGTGAAGGCCGTTGCCGTCC-3′;引物2：5′-TTAGCCTTGCAGACCAATAATAC-3′ 进行EuCuZnSOD基因的PCR扩增。以CaMV35s启动子部分序列设计的引物进行二次验证，引物3：5′-CAGGTCCCCAGATTAG CCTT-3′，引物4：5′-CGTGTTCTCT-CCAAATGA-3′，PCR反应程序如下：预变性94 ℃，5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环;72 ℃延伸10 min，琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 转基因巨尾桉的抗寒能力实验 将转基因组培苗-13.1 ℃冰箱暗处理，逆境处理3.5 h观察植株情况，直到5 h，取出拍照后置于组培室进行恢复培养， 3 d和100 d后观察植株生长状况。

1.2.4 NBT法检测SOD酶活性 SOD酶活性测定方法参照赵艳玲和周利建（2015）。植物材料取盆栽转基因巨尾桉植株叶片，测定的条件分别是25 ℃、4 ℃恒温气候箱中培养36 h和48 h。

1.2.5 实时定量PCR技术分析转基因植株EuCuZnSOD1表达量 巨尾桉叶片总RNA用Takara公司的RNA提取试剂盒，利用Takara SYBR ExScript 试剂和罗氏LightCycler 480仪器，以桉树4个样本的cDNA为模板，内参基因为巨尾桉18S rRNA（171 bp），引物设计分别为EuCSDF：5′-GGAAATGTCACTGTTGGTGC-3′;EuCSDR：5′-TCATCCGGATCAGCATGGAC-3′;Eu18SF：5′-CGCGCTACACTGATGTATTC-3′;Eu18SR：5′-GTACAAAGGGCAGGG ACGTA-3′，反应程序为预变性95 ℃，30 s;变性95 ℃，5 s;退火60 ℃，20 s，40个循环，最后延伸65 ℃，15 s，每个反应包括3个重复。

1.2.6 硫酸木质素含量测定 取巨尾桉转基因组培苗全株做硫酸木质素含量测定，参照赵艳玲等（2012）的方法。

2 结果与分析

2.1 转pBIEuCSD巨尾桉植株的获得

pBIEuCSD植物的二元表达载体质粒通过BamHⅠ和SacⅠ双酶切验证连接成功，农杆菌介导的叶盘法转基因巨尾桉，图1所示为整个转化过程的部分图片，芽分化在培养基中培养60 d后，不定芽从愈伤组织中分化（图1：A），芽长至2 cm移至生根培养基中继续抗性筛选，抗Kan的转基因巨尾桉正常生长（图1：B）并生根（图1：C），经初步筛选共得到46株抗性植株。

2.2 PCR检测pBIEuCSD转基因巨尾桉

对初步筛选所得到的46株转基因植株进行PCR检测。EuCuZnSOD1克隆自巨尾桉，以该基因作为阳性指标检测到31株阳性植株，存在假阳性问题。以CaMV35S启动子上的部分序列为模版设计引物，对得到的31株检测阳性植株进行二次PCR验证，若为阳性植株应有约900 bp的目的片段。从图2可以看出，有10株转基因植株在900 bp左右有条带，通过双PCR验证，最终得到pBIEuCSD转基因巨尾桉阳性植株10棵。

2.3 pBIEuCSD转基因巨尾桉抗寒性分析

通过不同的低温设置研究组培苗的最低耐受温度， 经预实验得到-13.1 ℃暗处理3.5 h后普通组培苗萎蔫现象严重甚至死亡。本实验将生长状况相同的转基因阳性和阴性巨尾桉放置在同一组培瓶中培养至生根，于-13.1 ℃放置3.5 h，观察发现36和47号转基因植株有明显冻伤，停止低温处理，其余的转基因阳性植株无萎蔫现象，重新放回-13.1 ℃放置5 h，结果发现49、52、53、55、44号转基因阳性植株在冻害后表现为茎尖萎蔫，组培室培养72 h后植株茎上部1/3处萎蔫。40、41和42号巨尾桉冻害后植株无明显冻伤，组培室培养 72 h后40号植株无萎蔫现象，41和42号植株茎尖有所萎蔫，不换瓶培养100 d后，40和41号巨尾桉全株成活，而42号植株底部叶片白化，重新发芽，如图3所示。

表1统计了冻害后转基因植株的恢复程度，经-13.1 ℃冻害实验的植株光照培养100 d后，转基因阳性植株只有47号全株白化死亡，对照植株有4株完全死亡;底部叶片白化但重新发芽的转基因植株有4株，阴性对照有7株;有5株转基因植株完全没有白化现象，生长良好，但是完全存活的阴性植株为0株，说明EuCuZnSOD1基因转入巨尾桉后，确能增强植株的抗寒能力且低温处理后的复壮能力强。

2.4 pBIEuSOD阳性转基因植株SOD酶活检测

参考刘奕清（2015）的方法，本研究在4 ℃氣候箱中对盆栽转基因巨尾桉植株低温胁迫处理，测定SOD酶活性。从图4结果可以看出，通过组培获得的盆栽苗的预试验发现在48 h的冷胁迫过程中，前36 h低温胁迫下SOD酶的比活力呈现出下降趋势，36 h左右SOD酶比活力达到最低，之后开始升高。

常温环境下，转基因植株的SOD比活力最高的是36号植株，但是36号植株的抗冻能力较差。抗冻能力最强的40和41号植株常温下的SOD比活力和对照差异较小。4 ℃低温胁迫下，巨尾桉抗冻能力较强的转基因植株40对低温胁迫较敏感，36 h胁迫后SOD比活力相比室温下的比活力降低了38%，48 h比活力比36 h的上升了2.1倍，对照植株比活力分别是降低了11%和上升了1.6倍。从酶比活力的分析发现巨尾桉转基因植株的SOD酶活性与抗冻能力的关联性不强。

2.5 qPCR分析转基因植株的EuCuZnSOD表达量

综合抗寒性实验和酶活性测定的实验结果，选取4株转基因巨尾桉进行实时定量PCR分析，包括酶活性最高但不耐冻的36号植株，最耐冻且酶活性对温度敏感的40和41号植株，酶活性较高且较耐冻的52号植株，以盆栽苗的叶片为研究对象，选择18S RNA作为内参基因对所有样品进行归一化处理，对不同样品之间的EuCuZnSOD基因表达量进行比较如图5。常温下耐寒能力强的40、41和52号转基因巨尾桉的EuCuZnSOD表达量是对照植株的9～10倍，在4 ℃低温胁迫下EuCuZnSOD表达量具有先升高后降低的特点，在4 ℃低温胁迫36 h时抗冻能力较强的40和41号转基因植株EuCuZnSOD的表达量分别升高到对照的16倍和36倍，较高的EuCuZnSOD的表达有利于植株抵御冻害。

2.6 转基因植株的硫酸木质素含量

将转基因植株组培苗的全株，包括根，茎，叶一起磨粉，硫酸木质素的含量测定结果见图6，转基因桉树的硫酸木质素含量除了40号和对照相比变化较小外，其它植株的木质素含量都降低了，其中41号转基因植株木质素含量比对照植株降低了56%。

3 讨论与结论

桉树是重要的纸浆林木，在林业生产中有非常明显的区域性。目前，低温、盐碱、重金属等环境因素严重限制了桉树人工林的推广及发展。CuZnSOD与植物的抗逆性有着密切关系。对CuZnSOD的转基因研究主要集中在耐盐、耐旱、耐储存、耐冻等能力的研究。研究发现克隆多抗花生的AhCuZnSOD基因，获得的转基因烟草的抗盐和抗旱能力明显提高（Negi et al，2015）。小麦CuZnSOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2转化烟草，转基因植株抵御盐胁迫能力增强（张海娜等，2008）。橡胶树中过表达细胞质CuZnSOD基因，获得耐旱的转基因橡胶树（Leclercq et al，2012）。李子的胞质CuZnSOD和APX转入李子组培苗后，转基因李子的快繁能力增强 （Faiza et al，2013）。

CuZnSOD基因和CAT1在木薯中过表达，木薯的采后生理恶化现象最少延迟10 d（Xu et al，2013）。实验证明，将叶绿体CuZnSOD和APX基因转入的甘薯具有较高的耐旱性且旱后恢复速度较快（Lu et al，2010），在盐胁迫下CuZnSOD相比对照植株表达量增加了13.3倍，可耐受100 mmol·L-1 NaCl（Yan et al，2016），耐寒能力和耐受SO2的能力也有所增强（Kim et al，2015）。西伯利亚蓼铜伴侣蛋白基因（PsATX）和CuZnSOD共转化的烟草耐盐，且比转单价基因植株具有更强的耐NaCl能力（马静等，2015）。本文的研究目标是通过CuZnSOD的过表达提高巨尾桉的抗寒能力，同时CuZnSOD的过表达可能也会增强巨尾桉对其它逆境环境的耐受能力，这方面的工作需要进一步的实验确定。

通过实时定量PCR技术，可以研究CuZnSOD基因的表达量与低温生理响应的关系。qPCR结果表明，虽然36号植株的SOD酶活性很高，但是CuZnSOD的表达量很低。抗寒能力较强的40、41和52号植株的CuZnSOD表达量较大，意味着CuZnSOD的过表达与转基因巨尾桉的抗寒能力正相关。转基因40和41号冻害后的恢复能力较强，而36和52号植株出现了寒害后白化并重生的现象，从48 h内的qPCR数据不能得出CuZnSOD表达量大与恢复能力有关，在组培苗-13.1 ℃冻害实验后的观察数据中，72 h的观察数据与最终的100 d的成活程度也是不同的，说明CuZnSOD的表达量与低温胁迫后的恢复能力可能需要更长时间的跟踪监测数据。

通过硫酸木质素含量的分析，发现过表达细胞质EuCuZnSOD基因没有导致木质素含量的升高，除了抗寒能力强的40号植株的木质素含量与对照差别较小外，其他转基因植株的木质素含量都降低了，尤其是41号巨尾桉的组培苗整株的硫酸木质素含量只有6.2%，这与拟南芥（Gill et al， 2010）中大量表达CuZnSOD增加木质化的研究结果差异较大，具体原因还有待进一步的研究确定。通过对巨尾桉CuZnSOD功能的研究，筛选得到了抗寒且低木质素的转基因巨尾桉，获得既速生优质又多抗的桉树新品系，使桉树在冷凉的温带地区以及多种复杂逆境环境中的推广种植成为可能。

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