miR-16、126表达预测糖尿病微血管并发症的临床价值

何继宏 杨 海 张芳娣 邱海山 陈远东

糖尿病主要以慢性血糖升高为临床特征，主要由胰岛素分泌不足或作用缺陷所引起，其具体发病机制尚不明确[1]。长期血糖控制不佳会诱发糖尿病微血管病变，明显增加致残率及死亡率，因此早期诊断、监控糖尿病微血管并发症对预防恶性事件发生有重要意义[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNAs)是一种新型基因表达调控因子，与胰岛素生成、分泌及胰岛素作用有密切关系[3]。近年来有研究显示[4-5]，miR-16、miR-126可参与糖尿病发生、发展，而且其在糖尿病血管并发症的发生中具有重要作用，但临床对于两者在糖尿病血管并发症中含量变化还需进一步研究。因此本次研究采取PCR方法定量检测2型糖尿病患者血清中miR-16、126表达水平，分析其在糖尿病发生、发展中的作用。结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入我院2015年6月-2017年12月于我院就诊的2型糖尿病(糖尿病组)、2型糖尿病微血管并发症患者(微血管并发症组)各40例为研究对象，本次研究经医院伦理委员会审查批准。2型糖尿病组患者均符合糖尿病诊断标准[6]，其中男25例，女15例；年龄20～72岁，平均(50.35±9.87)岁；体重指数18.54～31.95 kg/m2，平均(25.34±3.95)kg/m2；病程1～9年，平均(1.95±1.05)年。微血管并发症组患者均符合2型糖尿症诊断标准[6]，且发生微血管并发症，其中男23例，女17例；年龄22～76岁，平均(51.78±8.64)岁；体重指数19.05～32.87 kg/m2，平均(26.14±4.02)kg/m2；病程8个月～7年，平均(2.04±1.13)年。本次患者排除标准：年龄<18岁或>80岁；其他类型糖尿病；合并严重心血管疾病、甲状腺功能紊乱、急性感染及恶性肿瘤者。另选取40例健康体检者为对照组，男22例，女18例；年龄19～78岁，平均(50.95±8.05)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本收集与保存，采集80例患者及40例健康体检者空腹静脉血3 mL，3 000 r/min低速离心10 min，收集血清标本置于-80℃保存。

1.2.2 生化指标测定 采用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平，各检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，严格按照试剂盒操作说明书进行操作。

1.2.3 血清RNA提取及荧光定量PCR检测miR-16、miR-126 收集的血清标本中加入TRIZOL LS试剂及200 μL氯仿摇匀，静置15 min，4℃ 12 000 rpm离心10 min，将上层水相已至另一离心管中，加入异丙醇，4℃ 12 000 rpm离心10 min，弃上清液，加入乙醇，7 500 rpm离心5 min，加入100 μL 0.1%DEPC ddH2O，严格按照RNA回收试剂盒说明书纯化回收RNA。采用逆转录荧光PCR检测miR-16、miR-126，以U6为内参，引物及探针购自TaKaRa公司，严格按照实验室操作步骤进行操作。

1.3 观察指标 记录三组FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差异，并采用荧光定量PCR检测三组血清miR-16、miR-126变化，分析miR-16、miR-126对糖尿病微血管并发症的预测价值。

2 结果

2.1 三组血生化检测结果比较 微血管并发症组、糖尿病组FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。微血管并发症组与糖尿病组各生化检测结果比较均无显著差异(P>0.05)。见表1。

组别FPG(mmol/L)HbA1c(%)TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)微血管并发症组(n=40)9.26±2.181)9.68±2.541)4.75±1.952.15±0.651)3.12±0.571)1.05±0.071)糖尿病组(n=40)9.24±2.231)10.21±2.311)4.70±2.062.04±0.711)2.97±0.681)1.02±0.081)对照组(n=40)5.13±2.355.32±1.984.32±2.191.02±0.322.33±0.541.43±0.10

注：与对照组比较，1)P<0.05。

2.2 三组血清miR-16、miR-126比较 微血管并发症组、糖尿病组、对照组中miR-16呈降低趋势，miR-126呈升高趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别miR-16miR-126微血管并发症组(n=40)42.95±14.671)2)18.35±6.171)2)糖尿病组(n=40)26.69±9.462)26.97±9.862)对照组(n=40)15.06±0.9735.14±0.95

注：与糖尿病组比较，1)P<0.05；与对照组比较，2)P<0.05。

2.3 miR-16、miR-126对糖尿病微血管并发症的预测价值分析 miR-16预测糖尿病微血管并发症的ROC曲线下面积0.810，标准误为0.051，P=0.000，95%置信区间为0.710～0.910，当最佳截断值为32.62，此时敏感度与特异度均为0.825。miR-126预测糖尿病微血管并发症的ROC曲线下面积0.784，标准误为0.051，P=0.000，95%置信区间为0.683～0.884，当最佳截断值为20.42，此时敏感度与特异度均为0.825，特异度为0.725。见图1-图2。

图1 miR-16预测糖尿病微血管并发症的ROC曲线

图2 miR-126预测糖尿病微血管并发症的ROC曲线

3 讨论

miRNAs与特异性靶信使结合后可在转录水平上抑制基因表达，可调控细胞周期，参与疾病进展，而且这些循环miRNAs在血浆中含量稳定，检测方便、无创，有可能成为预测、诊断糖尿病及其相关微血管并发症的生物标志物[7-8]。目前临床有大量研究显示[9-11]，miRNAs与糖尿病发病机制有密切关系，而且其与胰岛素发育、生成及分泌有关。

本次研究显示，微血管并发症组、糖尿病组各生化指标与对照组间有显著差异，但糖尿病微血管并发症患者生化指标与糖尿病并无显著差异，与既往研究结果相符[12]。但通过PCR技术检测患者体内miRNAs含量变化结果显示，糖尿病微血管并发症患者miR-16表达显著高于糖尿病患者，提示miR-16或许可作为诊断糖尿病微血管并发症的辅助标志物。本次研究还显示，miR-16预测糖尿病微血管并发症的ROC曲线下面积0.810，当最佳截断值为32.62，此时敏感度与特异度均为0.825，这也进一步提示miR-16有望成为糖尿病病情进展及血管并发症的相关血清标志物。万淑君等[13]研究

显示，糖尿病肢体缺血患者血液循环中miR-16含量增高，而且在血管重建术后狭窄与血液中miR-16水平有关，在预测预后方面有一定价值。

miR-126在人内皮细胞中表达，其在血管形成、血管炎性反应方面有重要意义。本次研究显示，糖尿病微血管并发症患者及单纯糖尿病患者体内miR-126表达低下，而且糖尿病微血管并发症患者miR-126与糖尿病患者之间也存在差异，miR-126预测糖尿病微血管并发症的ROC曲线下面积0.784，当最佳截断值为20.42，此时敏感度与特异度均为0.825，提示血清miR-126可作为糖尿病及微血管并发症的生物标志物。郭晓莉等[14]研究显示，在肝细胞中，miR-126可靶向抑制胰岛素受体底物而发生胰岛素抵抗，这也进一步反应血清miR-126与糖尿病进展密切相关。虽然目前临床对于miR-16、miR-126在糖尿病及糖尿病微血管并发症方面取得一些研究，但关键的基因分子仍需后续研究进一步探讨。

综上，miR-16、miR-126与糖尿病微血管并发症发生有关，可为糖尿病及其微血管并发症的诊断及治疗提供一个新思路。

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