高海拔地区血液基因组DNA提取条件优化

范东艳,杜宝中,王 苹,全雄杰

(1.西藏大学医学院，西藏 拉萨850000;2.吉林大学第一医院，吉林 长春130021;3.西藏阜康医院，西藏 拉萨850000)

全血基因组DNA是科学研究、临床疾病分析及亲子鉴定等许多研究领域不可缺少的原材料。目前，提取DNA的各类方法较多，除各实验室有自身独特的方法外，应用最为广泛的还属商品化的血液基因组提取试剂盒，不仅使用方便成本低廉且液体量较少相对污染较低。西藏自治区地处我国西南边疆，平均海拔在3000米以上，由于地势高而形成了特有的高原低压低氧、寒冷干燥的环境。在高原环境中提取血液基因组可采用商品化的血液基因组提取试剂盒，但是如果按照试剂盒中说明书方法进接提取血液基因组其产量和纯度很难满足后续研究的需要。本课题组经过多次尝试研究，摸索出了一套血液基因组试剂盒提取DNA的优化方法，该方法在高原环境下提取的DNA能够获得满意的产量和纯度。

1 材料与方法

1.1实验材料

2017年5月西藏阜康医院体检的健康体检者的血液样品109份作为基因组DNA提取的材料。

1.2主要试剂与仪器

RelaxGene Blood DNA System 血液基因组DNA提取系统(非离心柱型)[天根生化科技(北京)有限公司]，其产品组成：细胞裂解液CL2×250 ml，缓冲液FG 120 ml，洗脱缓冲液TB60ml，蛋白酶K1 ml。其余试剂为分析纯，水为双蒸灭菌水。

高速台式离心机(Sigma)；超微量紫外可见分光光度计(Thermo)。

1．3实验分组

将109份血液样品的每一份分为2组：实验组(109份)和对照组(109份)。

1．4实验方法

1．4．1 对照组按300 μl抗凝血750 μl裂解液提取DNA，具体的操作方法对照组采用RelaxGene Blood DNA System 血液基因组DNA提取系统试剂盒说明书提取方法。

实验组按300 μl抗凝血900 μl裂解液提取DNA ，采用RelaxGene Blood DNA System 血液基因组DNA提取系统(非离心柱型)试剂盒，对实验条件和方法进行优化和改良，其方法是：1)将抗凝血样(2 ml血液/管)从-80℃冰箱中，室温融化，利用移液器在样品管中把血样充分混匀，取300 μl血样置于尖底离心管中并向管中加入750 μl细胞裂解液CL，颠倒混匀10次。重复2次。2)离心12 000 rpm 1 min、 弃上清，将离心管倒置于干 净吸水滤纸上5 min，此时确保管底沉淀在管中。3)按100∶1配制FG与蛋白酶K混合液，现用现配。将混合液按照200 μl/管的量加入到已弃上清并倒置5 min的EP管内，立即涡旋混匀至无团块。4)65 ℃水浴过夜(20 h)，最初的2 h内每10-15 min颠倒混匀2-3次，并用手指弹匀，水浴后可见溶液的颜色从红色变为黄绿色。5)加入异丙醇150 μl，涡旋混匀至丝状或簇状DNA为止。6)离心12 000 rpm 5 min、弃上清将EP管倒置于干净的吸水滤纸上、确保沉淀在EP管中、加入150 μl 70%乙醇、涡旋振荡5 s、离心12 000 rpm 2 min弃清，再次重复加入150 μl 70%乙醇、离心弃上清后将EP管倒置于干净的吸水滤纸上，15 min。6)加入100 μlTB缓冲液，室温过夜(24 h)。

1．4．2 DNA浓度、纯度的检测采用紫外线分光光度法[3]。

1．5统计学方法

2 结果

2.1DNA不同浓度比例比较实验组109份样品中DNA浓度没有<20 ng/μl，有13份DNA浓度在20-50 ng/μl之间，35份DNA浓度在51-80 ng/μl之间，61份样品DNA浓度>80 ng/μl； DNA浓度比例高于对照组见表1。

表1 实验组与对照组DNA不同浓度比例比较(ng/μL)

2.2DNA不同纯度比例比较实验组109份样品中DNA纯度OD260/OD280比值在≥1.7-<1.9之内的有105份，比值小于1.7的有3份，比值≥1.9的有1份， DNA纯度比例高于对照组见表2。

表2 实验组与对照组DNA不同纯度比例比较(OD260/OD280)

3 讨论

临床医学疾病研究、分子生物学、遗传学等流行病学的调查研究都离不开高纯度、高分子量的血液基因组(DNA)[1-3]。现今，DNA的提取方法较多，也有多种品牌的提取试剂盒可供选择使用。但青藏高原平均海拔较高，如果使用常规化学方法提取DNA因使用有机溶剂量较多不但运输不便而且也会对环境造成污染。最恰当的方法就是利用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，不但操作简便而且有机溶剂的使用量也非常小，并可将获得的DNA直接用于下游实验[4]。西藏地区地处高原大气压低于平原地区且干燥低温对DNA的提取有一定的影响，本课题组在平原地区采用天根RelaxGene Blood DNA System 血液基因组DNA提取系统试剂盒提取DNA，按照说明书方法操作，获得的DNA的浓度和纯度均能满足下游实验的需求，但在西藏大学医学院分子生物学实验室(拉萨市平均海拔3600米)采用说明书方法提取DNA时无论是纯度还是浓度均无法满足下游实验要求所以经过多次实验总结提出了天根DNA提取系统在高原地区使用的改良方案：(1)在300微升抗凝血中加入细胞裂解液CL由原来的750 μl改为800 μl；(2)加入蛋白酶K FG混合液后65 ℃水浴由原来的10 min改为过夜(20 h)；(3)将说明书上的加入200 μl TB缓冲液改为100 μl，65 ℃水浴1 h改为过夜(24 h)。

在高原环境提取DNA的过程中，首先将-80℃保存的抗凝血室温融化后按照改良方案细胞裂解液使用量为血液的3倍，颠倒混匀10次使DNA分离出来[5,6]；加入蛋白酶K和FG混合液后水浴20 h,样品溶液透明，推断由于环境因素导致裂解时间延长；加入TB洗脱液后水浴24 h后采用紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度。根据文献报道DNA纯度判断标准：纯DNA，其OD260/OD280比值范围应为1．7-1．9；OD260/OD280比值>1．9，表明有RNA污染；OD260/OD280比值<1.6，表明有蛋白质等污染[7]。实验组109份样品中35份DNA浓度在51-80 ng/μl之间，61份样品DNA浓度>80 ng/μl； DNA纯度OD260/OD280比值在≥1.7-<1.9之内的有105份，比值小于1.7的有3份，比值≥1.9的有1份， DNA浓度和纯度比例均高于对照组。

采用改良方法在高原地区提取的DNA无论是完整性还是浓度纯度均能保证后续实验研究的需要同时适合临床研究及检测应用。

作者简介：范东艳(1973-)，女，博士,博士后,副教授,主要从事低氧环境对机体健康影响研究。

参考文献：

[1]王秀娟，肖 瑞，张传领，等．血液基因组DNA试剂盒提取条件的优化[J]．疾病监测与控制杂志，2015，12(9)：855.

[2]韩芬霞，杨丽芬．全血DNA提取方法的改进及PCR检测[J]．江苏农业科学，2012，40(8)：56．

[3]余凯琳，邓正栋，严 济．血液基因组DNA提取方法改良[J]．南昌大学学报(医学版)，2014,54(10)：9.

[4]袁茂勇，郭 斌，宋 欢，等．DNA定量分析在宫颈病变筛查中应用价值的研究[J]．南昌大学学报：医学版，2011，51(6)：68．

[5]刘正旺，云美玲，钟江华，等．提取陈旧血液标本中DNA的三种方法比较[J]．中国热带医学，2012，12(3)：321．

[6]许丽娟，马 骁，王洋阳，等．一种快速、经济提取外周凝血基因组DNA方法的建立[J]．现代生物医学进展，2011，11(20)：3946．

[7]段 莹，于卫建．-40 ℃条 件 下 储 存 不 同 时 间 的 全 血 对 提 取DNA浓度的影响[J]．中国输血杂志，2011，24(11)：973．