儿茶素-稀土配合物的合成、表征及抗菌活性

余康，田翠翠，李霞，廖学品,2,3,＊，石碧,2,3

1四川大学生物质与皮革工程系，成都 610065

2四川大学，皮革化学与工程教育部重点实验室，成都 610065

3四川大学，制革清洁技术国家工程实验室，成都 610065

1 引言

食源性细菌以食品为主要渠道进行传播和感染，是影响食品质量与公共安全的重要生物污染源。随着抗生素为主的抗菌药物的长期使用，食源性细菌的耐药性问题已日趋严重。因此，开发多靶点、高效又安全的新型抗菌药物替代抗生素变得越来越重要1。

儿茶素(Catechin，简称C)属于黄烷醇类物质，广泛存在茶叶、落叶松等植物体内，是具有多元酚结构的次级代谢产物，其B环上的邻位酚羟基较高的加质子常数 lg KH表明其具有很好的反应活性，能以疏水键-氢键与蛋白质(酶)多点键合2,3，其分子中邻位酚羟基可以与金属离子形成稳定的五元螯合环4,5。此外，儿茶素还可以与多糖、脂质、生物碱及 DNA发生复合反应6–8。儿茶素可对多种微生物产生作用，Díaz-Gómez等9发现儿茶素对幽门螺杆菌的OD600影响甚大。Keller等10的研究表明 5 mg·m L−1的儿茶素可使肠道病原志贺氏菌数量减少 50%，同时，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(M IC)达到 0.625 mg·m L−1。由此可见，儿茶素可以与维持细胞生理活性的多种物质反应并对细菌表现出一定的抑制作用。但是，由于C稳定性差、膜穿透性不强11，在体内对细菌的抑制作用相对较弱。另一方面，稀土(Rare earth，简称 Re)作为一类具有特殊电子层结构的金属元素，随着稀土生物无机化学及其应用的发展，发现其具有抗凝血、抗炎杀菌、抗肿瘤等多种生物作用，并且可以与蛋白质(金属酶)发生竞争性结合而影响蛋白质活性，也可以水解磷酸二酯键进而损伤遗传物质DNA，还能够改变磷脂表面电荷，影响与磷脂的结合牢固程度，同时，还可以与 Ca2+竞争磷脂上的结合位点引起细胞膜代谢功能的紊乱12–14。Wakabayashi等15的研究表明稀土对细菌、真菌、线虫都有一定的杀菌作用，表现出广谱抗菌性。Fujita等16发现在模拟废水加入稀土Y或Eu (100 mg·m L−1)对硝化细菌的硝化作用具有显著抑制。稀土离子Gd3+和Yb3+能明显地抑制线粒体超氧化物歧化酶(SOD)的活性17。但是稀土离子的水溶性过强且易水解，与细胞的亲和力较弱，难以到达细胞作用靶点，影响了其在抗菌领域的应用。因此，寻求合适的配体对于提高稀土的抗菌性能至关重要。

稀土离子属于硬Lew is酸，离子半径大、配位数高，易于和含氮、氧原子的硬碱配体配位，表现出强的亲氧性18。而儿茶素是具有一定疏水性的多酚化合物，邻位酚羟基可以与 Re3+发生配位反应，得到具有脂溶性的配合物 Re3+-C，从而使 C和 Re3+的抗菌活性优势互补。由于该配合物解决了Re3+水溶性过强的问题及C的稳定性差、膜穿透性弱的问题，配合物Re3+-C将表现出更强的抗菌活性。另一方面，儿茶素及稀土本身对微生物具有一定的抑制作用，儿茶素能够与蛋白、多肽及糖蛋白结合，儿茶素在作为抑菌剂的同时又可以作为载体将稀土有效的输运到细胞中，从而增强稀土及儿茶素的抑菌作用。因此，本文以C为配体，合成了3种稀土配合物(La3+-C、Gd3+-C、Er3+-C)，并研究其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及沙门氏菌4种食源性细菌的抗菌活性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

傅里叶变换红外光谱(IS10美国)、紫外可见分光光度计(UV-1800PC上海)、X射线光电子能谱(ESCA-850 日本)。

轻稀土：La(NO3)3·6H2O；中重稀土 Gd(NO3)3·6H2O；重稀土 Er(NO3)3·5H2O，均购于 A laddin(99%)。

儿茶素C(98%)购于上海瀚鸿化工科技有限公司。

大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC23656)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853)购于中国工业微生物菌种保藏中心，沙门氏菌(Salmonella SIIA235)由四川大学制革生物技术研究室提供。液体培养基为营养肉汤培养基(Nutrient Broth，NB)，固体琼脂平板和试管斜面培养基均在NB培养基中添加1.5%琼脂。

2.2 实验方法

2.2.1 配合物的合成

按照摩尔比4 : 1，分别准确称取一定量的C和Re(NO3)3溶于适量的二次水中，将Re(NO3)3以滴加的方式缓慢加入到C溶液中，在室温下混合搅拌反应6 h，冷冻干燥得到配合物Re3+-C。

2.2.2 菌悬液的制备

先将各试验菌株于试管斜面培养基上活化培养 18 h，然后刮取数环生长良好的菌落于无菌生理盐水中，并与 0.5麦氏比浊管(相当于菌悬液浓度 1.5 × 108CFU·m L−1，CFU，Colony-Form ing Units)对照，用无菌生理盐水将各菌悬液浓度稀释至 1 × 106CFU·m L−1。

2.2.3 抗菌活性的测定

抑菌圈：采用水平扩散法(牛津杯法)，将高温灭菌的培养基趁热加入无菌培养皿中，待其凝固制得无菌平板。吸取预先准备的菌悬液200 μL于无菌平板上，经无菌涂布棒涂布均匀，将无菌牛津杯轻置于含菌双碟平板表面，接着取200 μL相应浓度的配合物溶液注入牛津杯内，然后于37 °C培养箱中培养24 h，测量各平板抑菌圈直径(mm)。

最小抑菌浓度(M IC)：以二倍梯度稀释法配制系列浓度的Re3+-C溶液，分别取1 m L加入无菌小试管中，利用营养肉汤培养基将菌悬液稀释至1 × 106CFU·m L−1。同时将等量的含菌培养液加入到各无菌小试管中，于37 °C培养24 h。观察其生长情况，以抑制细菌生长的最低配合物浓度(试管溶液澄清透明)为最小抑菌浓度19。

最小杀菌浓度(M BC)：取适量的最小抑菌浓度及其以上浓度的培养液于无菌琼脂平板上，37 °C培养24 h。观察其生长情况，以没有细菌生长的琼脂平板的最低配合物浓度为最小杀菌浓度。

采用统计学软件(SPSS19.0) 实验数据进行显著性分析。

3 结果与讨论

3.1 配合物的表征

儿茶素又称儿茶精，是很多缩合类单宁的结构单体，为黄烷醇类的衍生物，分子式为C15H14O6。其分子结构中 B环上的邻位酚羟基的lg KH比A环上两个间位的酚羟基大，这表明B环具有较高的配位活性，从而使得其邻苯二酚结构与金属离子的络合反应最容易发生。因此，稀土金属离子Re3+与儿茶素B环邻位酚羟基发生配位反应，形成具有五元螯合环的Re3+-C配合物20，反应原理如图1a

3.1.1 傅里叶变换红外(FT-IR)光谱分析

采用KBr压片法测得C和Re3+-C的红外特征吸收光谱，如图 2所示。配合物的红外谱图与配体 C相比发生了明显的变化。3种配合物的特征吸收基本相似，表明 3种配合物在结构上具有相似性。儿茶素分子中 O―H键伸缩振动吸收峰出现在 3354 cm−1处，而当其与稀土离子(La3+、Gd3+、Er3+)形成配合物后吸收峰均向高波数移动。此外，1610–1530 cm−1苯环的骨架振动也明显减弱20。同时，儿茶素在1346与1238 cm−1的吸收峰为 O―H键面内弯曲振动和 C―O键伸缩振动耦合所致，而配合物Re3+-C在这两处的吸收峰明显减弱或者消失，这均表明稀土金属离子与酚羟基的氧配位成键21.22。

图2 C及Re3+-C的红外光谱图Fig.2 FT-IR spectra of C and Re3+-C.

3.1.2 紫外(UV)光谱分析

图3为C及Re3+-C的紫外扫描图谱。在C的紫外图谱中，273 nm处出现一个明显的吸收峰，是C分子结构中的酚羟基的特征表现。在与Re3+发生络合反应后，使得配体C的电子云密度降低，整个分子中电子的离域程度增大，π电子的流动性增强，从基态跃迁到激发态所需的能量减小，因此该处特征吸收峰红移至276 nm且吸光值有所减小23。

3.1.3 X射线光电子能谱分析(XPS)

C及Re3+-C的O 1s图谱如图4所示。C的O 1s图谱仅有一个峰处于532.85 eV，这是C分子结构中C―OH的O所表现出来的。而在Re3+-C配合物中均出现两个峰，峰1为酚羟基的C―OH，峰2则是因为螯合环的形成，酚羟基的O受到Re3+正电荷的影响，其电子云密度向 Re3+离子的空轨道偏移而降低，结合能(EB)位移至高能场24。

3.1.4 Re3+-C配合物配位数的测定

C与稀土离子 Re3+发生配位反应时，酚羟基的离解促进了H+的释放，使反应体系的pH降低，可以根据反应后 pH的减少量来确定与 Re3+反应的配位数25。图5所示为不同摩尔比的C与3种Re3+配位反应后pH的减少量。可以看出，对于同一种稀土而言，随着摩尔比的增加，体系pH呈下降的趋势，此时ΔpH随之增大且在摩尔比为4 : 1时达到最大并趋于稳定。此外，比较相同摩尔比时不同稀土离子与C反应体系，随着原子序数的增大，稀土 Re3+的半径减小，配合物 Re3+-C中的Re―O键逐渐增强，而配体C的―OH上H受到中心离子(Re3+)的排斥作用更强，则其更容易离解释而放出质子(H+)，使得反应体系pH降得更低26。因此，ΔpH随Re3+原子序数的增大而增加，并且配合物的稳定性也随之增加。

由稀土离子 Re3+的配位反应特性可知，其常见配位数为6–12，而C的分子结构中B环的邻位酚羟基具有较高的反应活性，因此Re3+-C的配位数极有可能为8。其可能的结构如图1b所示。

图3 C及Re3+-C的紫外光谱Fig.3 UV spectra of C and Re3+-C.

图4 C (a)及Re3+-C (b, c, d)的O 1s XPS图谱Fig.4 O 1s XPS spectra of C (a) and Re3+-C (b, c, d).

3.2 配合物抗菌活性

表1为C、Re3+及Re3+-C对4种常见食源性细菌的抑菌圈直径，数据统计分析表明在p ＜ 0.05水平Re3+-C配合物与Re3+相比差异显著。可见，在一定范围内，抑菌圈直径与抑菌活性成正相关，因此，抑菌圈大小可以初步表征抑菌活性的强弱。由表中可以看出，四种细菌对C均不敏感，三种稀土离子 Re3+对四种测试菌株虽然都具有一定的抑制作用，但抑菌圈差异不大且抑菌效果并不显著。相较Re3+及C而言，配合物Re3+-C的抑菌性能明显提高，特别是对金黄色葡萄球菌表现出很强的抑菌性能，这可能是因为不同微生物细胞膜(壁)结构上的差异27，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，其细胞壁中肽聚糖含量为50%–80%，而绿脓杆菌、沙门氏菌及大肠杆菌这三种属于革兰氏阴性菌，肽聚糖含量仅为5%–20%。因此，对于不同的菌株，配合物Re3+-C表现出了一定的差异性。

图5 C与Re不同摩尔比反应体系的pH变化量Fig.5 pH reduction of catechin and rare earth chelating

表1 抑菌活性(抑菌圈)的测定Tab le 1 Antibacterial activity(inhibition zone) of C, Re3+ and Re3+-C.

表2 C, Re3+ 及Re3+-C对四种食源性细菌的最小抑菌浓度Table 2 M IC of C, Re3+ and Re3+-C against four kinds of food-borne bacteria.

表2为C、Re3+及Re3+-C对4种食源性细菌的M IC值。相较于C与Re3+单独作用，3种配合物的M IC值均明显降低，虽然表1中Re3+与Re3+-C的抑菌圈表现差异不大，相较Re3+及C而言，配合物 Re3+-C的抑菌性能明显提高(统计学软件SPSS19.0分析在p ＜ 0.05水平差异显著)，这可能是因为抑菌圈大小作为初步评价抑菌活性指标存在一定的局限性。从M IC值可以看出配合物Re3+-C的抑菌活性可以看出，Re3+与 C的协同效应非常明显。研究表明28,29，Re3+进入细胞内引起的生物效应主要与 Ca2+相关，而在生物体内，几乎所有的生理活动都受到 Ca2+的调控，而三种稀土Re3+的离子半径(1.061–0.881 nm)与 Ca2+的离子半径(0.990 nm)都较为接近，而且Re3+对四种食源性细菌的抑菌活性随着稀土原子序数的增大而增加，这是因为重稀土比轻稀土及中重稀土的生物毒性高30。因此，对于配合物Re3+-C，其首先利用C的脂溶性到达细胞膜31，从而减少了穿透细胞膜磷脂双分子层的阻力，一方面使细胞与环境的能量和物质交换发生障碍，另一方面 Re3+进入细胞内可能干扰了 Ca2+的正常生物作用，引起细胞代谢紊乱，这可能是Re3+-C具有良好抑菌性能的原因。表 3是文献报道的稀土配合物及其抗菌活性。可见，Re3+-C的抗菌活性较高，特别重要的是儿茶素来源广泛且无毒，因此，Re3+-C具有广阔的应用前景。

表4是C、Re3+及Re3+-C对4种食源性细菌的MBC，与Re3+及C相比，配合物Re3+-C的MBC值也显著降低。结合表1、表2、表4可以发现，Re3+-C配合物的抑菌活性与Re3+和C相比均大大提高。一方面，这是因为Re3+-C的形成增加了Re3+的脂溶性，脂溶性影响配合物穿透细胞膜的能力，这对于Re3+抑菌活性的提高至关重要。另一方面，我们的前期研究表明22，配合物Re3+-C的稳定性随稀土原子序数增大而增大，稳定性则影响配合物Re3+-C进入细胞中释放Re3+的能力，因此，只有稳定性合适的 Re3+-C配合物才能更好地发挥 Re3+的作用。而Er3+-C的稳定性太强，Er3+难以在细胞中得到释放，而相对较轻的稀土则更容易释放并发挥作用。因此，配合物Re3+-C活性大小顺序为Gd3+-C ＞ La3+-C ＞ Er3+-C。再者，因为稀土离子(Re3+)和钙离子(Ca2+)的半径相当，而研究表明稀土可以进入细胞取代Ca2+而影响微生物代谢，离子半径越接近Ca2+，对细胞的影响就越大，因此配合物Re3+-C的半径大小对抗菌性也有很大的影响。而Gd3+与Ca2+的离子半径最为接近(分别为 0.938和 0.990 nm)，因此，Gd3+-C的抑菌活性相对较好。

表3 不同配体的稀土配合物的抗菌活性Tab le 3 Antibacterial activity of rare earth com p lexes of different ligands.

表4 C, Re3+及Re3+-C对四种食源性细菌的最小杀菌浓度Table 4 M BC of C, Re3+ and Re3+-C against four kinds of food-borne bacteria.

4 结论

水相中儿茶素 C可与稀土离子 Re3+形成配合物，配位数为8，配合物稳定性与Re3+的结构有关。由于儿茶素 C增加了 Re3+的脂溶性，使得 Re3+-C的抗菌活性较Re3+显著提高，并表现出明显的协同作用，同时，Re3+-C对四种食源性细菌的抗菌活性表现出一定的差异性，这与供试菌株的性质及配合物自身的结构(如中心离子半径，配位数，稳定性等)有关。后续将对稀土离子在细胞中的分布以及Re3+-C的作用靶点展开研究，同时，Re3+-C纳米抗菌剂同样具有广阔的研究前景。

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