黄体酮阴道环中有关物质检测的方法学研究

邱顺晨 姚小东 刘振齐 谷翊群 宁美英

国家卫生计生委科学技术研究所药物和医用材料研究中心(北京，100081)

黄体功能不全不仅能导致闭经、功能性子宫出血等，还是造成不孕和流产的重要原因。因此，给予黄体支持成为多数辅助生殖技术的常规步骤之一。目前应用的黄体支持药物主要有人绒毛膜促性腺激素(hCG)、天然黄体酮及人工合成的孕酮类激素。研究报道称合成孕酮类激素具有致畸胎作用而天然黄体酮未见相关报道[1]。因此，以黄体酮为原料药开发的黄体支持产品具有良好的市场前景和经济效益。阴道给药是一种新兴的给药系统，黄体酮缓释凝胶Crinone是一种由微粉化黄体酮制备而成的供阴道给药的凝胶剂。大量研究表明，Crinone不仅与肌注具有相同的疗效[2-5]，还兼具阴道给药的优点。然而，Crinone仍然存在以下缺点：需要每天使用，患者顺应性不好；药物释放不够平稳；凝胶易流出污染衣物。阴道环也是阴道给药系统中的一个剂型[6]，相对于阴道凝胶，具有不需要每天给药；患者可自行取放，顺应性更好；不会污染衣物；药物释放更加平稳等优点。本研究采用了注塑成型法制备黄体酮阴道环[7]，建立了黄体酮阴道环中有关物质的高效液相色谱(HPLC)检测方法并进行方法学验证，旨为黄体酮阴道环制剂的体外质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

黄体酮原料药(云南丽江映华生物药业有限公司，批号：1511001W)；MED-6382液体硅橡胶(美国Nusil Technology，批号：63227)；辛酸亚锡催化剂(美国Nusil Technology，批号：63227)；乙腈(Fisher公司，色谱纯，批号：150011)；甲醇(Fisher公司，色谱纯，批号：150939)。

1.2 仪器

Sartorius-BT224S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；CSR-4-10超纯水机(北京爱斯泰克科技开发有限公司)；阴道环模具(北京东洛机电有限责任公司)；ED23型烘箱(德国宾得公司)；药物光照试验箱(YG120,上海一恒科技有限公司)；RT5型磁力搅拌器(ZKA公司)；Waters2695高效液相色谱仪，Waters2487检测器(Waters公司)；Diamonsil C8型液相色谱柱(北京迪科玛科技有限公司)。

1.3 黄体酮阴道环的制备

将阴道环模具置80℃的烘箱中预热15min。称取黄体酮1.33g，MED6382硅橡胶10g，混合均匀后按照100:0.5的比例加入辛酸亚锡催化剂，继续搅拌15s。快速将混合物加入到10ml注射器中，匀速且快速地注入到预热好的模具中。将模具放到80℃烘箱中加热30min，成型后开模取出即得。

1.4 实验方法

1.4.1 HPLC检测条件色谱柱Diamonsil C8(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)；检测波长241 nm；流速1.5 ml/min；进样量10 μl；柱温30℃。

1.4.2供试品溶液的配制取黄体酮基质型阴道环(含黄体酮400 mg)，切成0.5mm薄片，置于装有100 ml甲醇的锥形瓶中，室温下磁力搅拌24h后， 经0.45μm 滤膜滤过。取续滤液1ml于100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取1 ml稀释液于25 ml的容量瓶中，加甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀释至刻度，摇匀，于4℃冷藏，备用。

1.4.3自身对照溶液的配制精密量取1.4.2项下黄体酮供试品溶液1.0 ml，置于100 ml量瓶中，用甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀释至刻度，摇匀，得黄体酮自身对照溶液，于4℃冷藏，备用。

1.5 专属性试验

1.5.1空白干扰按照1.3的方法制备2个空白阴道环，再将其均匀切成薄片(厚度0.5 mm)，置于装有100ml甲醇的具塞锥形瓶中，磁力搅拌24h，经0.45μm 滤膜滤过，取续滤液1.0 ml置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，HPLC法检测，记录色谱图。

1.5.2酸破坏取黄体酮阴道环，切成0.5mm 薄片，置于具塞锥形瓶中，再加1mol/L 盐酸溶液适量，于室温放置24h，加0.1mol/L NaOH 溶液调节至中性，加100ml甲醇。室温下磁力搅拌24h，经0.45μm 滤膜滤过，取续滤液1 ml于100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取1 ml稀释液于25 ml的容量瓶中，加甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀释至刻度，摇匀，HPLC法检测，得到峰面积数据。

1.5.3碱破坏取黄体酮阴道环，切成0.5mm 薄片，置于具塞锥形瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液适量， 于室温放置24h， 加0.1 mol/L 盐酸溶液调节至中性，再加100ml甲醇。同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC法检测，得到峰面积数据。

1.5.4氧化破坏取黄体酮阴道环，切成0.5 mm薄片。加3% 过氧化氢试液适量，室温放置8h，加100ml甲醇。同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC法检测，得到峰面积数据。

1.5.5高温破坏取黄体酮阴道环，切成0.5mm 薄片，置于具塞锥形瓶中，于60℃烘箱中放置24h后取出，放至室温，加100ml甲醇。同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC法检测，得到峰面积数据。

1.5.6光照破坏取黄体酮阴道环，切成0.5 mm 薄片。于( 4500±500) Lx光照条件下放置48h，置于具塞锥形瓶中，加100 ml甲醇。 同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC法检测，得到峰面积数据。

1.6 检测限

将黄体酮对照品储备液进行稀释，按照1.4.1 HPLC检测条件进行HPLC检测， 直到信噪比(S/N)为3/1，计算得到检测限。

1.7 重复性试验

按1.4.2方法平行制备黄体酮供试品溶液，按1.4.3方法平行制备黄体酮自身对照溶液各6份，进行HPLC检测。按主成分自身对照法计算黄体酮中未知杂质含量。

1.8 溶液稳定性试验

取黄体酮供试品溶液，按照1.4.1项下色谱条件，分别于0，4，8，12，24h时进行HPLC检测， 记录主成分、有关物质及杂质的峰面积，考察样品稳定性。

1.9 有关物质检查

取3批黄体酮阴道环，制备黄体酮供试品溶液及自身对照溶液，分别精密量取10μl及自身对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液和对照液各10μl，分别进行HPLC检测，记录色谱图至黄体酮峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，用自身对照法计算杂质的含量。

2 结果

2.1专属性实验

2.1.1空白干扰试验黄体酮检测条件下的空白阴道环HPLC检测图谱见图1。结果表明，在黄体酮相应的保留时间并无其他峰出现，说明空白阴道环的硅橡胶辅料并不会对黄体酮的相关检测产生干扰。

2.1.2强制降解试验结果见图2所示。黄体酮阴道环经酸、碱、氧化、高温、光照破坏后，黄体酮会有轻微的降解，但是各降解产物峰与主要两峰均可达到良好分离。

图1黄体酮检测条件下空白阴道环HPLC检测图谱

图2在未处理(A)、酸(B)、碱(C)、氧化(D)、高温(E)、光照(F)条件下黄体酮阴道环HPLC检测图谱

2.2 检测限

黄体酮阴道环中黄体酮HPLC检测限为0.5 ng/ml。

2.3 重复性实验

6份供试品溶液中黄体酮杂质总和的相对标准偏差(RSD)为1.8 %，重复性良好。

2.4 溶液稳定性实验

黄体酮供试品溶液在24 h内杂质峰面积总和RSD为1.9 %，表明黄体酮供试品溶液在24 h内均基本稳定。

2.5 有关物质检查

3批样品测定结果见表1。统计结果表明，所制备的3批样品在黄体酮HPLC检测条件下，单杂质和总杂质含量均<0.5%，符合药典要求。

表1 黄体酮阴道环中黄体酮HPLC检测的杂质含量(%)

3 讨论

本研究对2015版药典中黄体酮的有关物质的检测方法进行了优化，经过不断的摸索，将原有的甲醇-乙腈-水(25:35:40，v/v)调整为甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)，实验结果显示，该比例下分离效果更好，峰形也更优。

由于阴道环制剂的特殊性，药物从硅橡胶中的彻底提取相对困难，因此对于药物的提取方法也进行了优化，通过对超声法、磁力搅拌法及两者结合法的考察，筛选了甲醇、乙腈两种提取溶剂，考察了不同的磁力搅拌时间，最终选择室温下磁力搅拌24h作为药物的提取方法。

本研究采用不加校正因子的主成分自身对照法对黄体酮阴道环中的有关物质进行检测。专属性实验结果表明辅料完全不干扰主药黄体酮的测定。有关物质检查结果表明，单杂质和总杂质含量均<0.5%，也不会对主药的检测结果产生干扰。

国内尚无关于黄体酮阴道环中有关物质的检测方法的报道，本研究优化了流动相比例，将HPLC法应用于黄体酮阴道环的有关物质的检测，经方法学验证，此法的专属性强，灵敏度高，符合相关规定的要求，可以为黄体酮阴道环质量标准的制订提供科学依据。

参考文献

[1] 陈红，宋学菇，随笑琳，等. 口服黄体酮在黄体支持中的作用 [J]. 中国妇幼保健, 2009, 24(11): 1526-1528.

[2] Berger BM, Philips JA. Pregnancy outcomes in oocyte donation recipients: vaginal gel versus intramuscular injection progesterone replacement [J]. J Assist Reprod Genet, 2012, 29(3): 237-242.

[3] Penzias AS, Alper MM. Luteal support with vaginal micronized progesterone gel in assisted reproduction [J]. Reprod Biomed Online, 2003, 6(3): 287-295.

[4] Gibbons WE, Toner JP, Hamacher P, et al. Experience with a novel vaginal progesterone preparation in a donor oocyte program [J]. Fertil Steril, 1998, 69(1): 96-101.

[5] Schoolcraft WB, Hesla JS, Gee MS. Experience with progeterone gel for luteal support in a highly successful IVF progromme [J]. Hum Reprod, 2000, 15(6): 1284-1288.

[6] Woolfson AD，Malcolm RK，Gallagher R. Drug delivery by the intravaginal route [J]. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 2000, 17(5): 509-555.

[7] 姚小东，宁美英. 黄体酮给药系统的研究进展 [J]. 中国计划生育学杂志，2014，22(12)：855-858.