不同时期卵巢癌移植瘤的携MMP-2抗体靶向超声造影剂诊断效能

林海宇，付丽君，向红，刘慧

卵巢恶性肿瘤早期检出率低，严重影响患者的5年生存率。靶向超声造影剂介导的分子成像克服了传统影像技术“同病异影、异病同影”的局限性，对癌症的诊断具有高度特异性[1]。本研究根据基质基属蛋白酶-2（matrix metallproteinase 2，MMP-2）在卵巢癌血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）中的特异表达及高表达，将其作为卵巢癌VM靶向作用位点，制作携MMP-2抗体的靶向超声造影剂。通过动态观察靶向超声造影剂和普通超声造影剂对卵巢癌移植瘤的血流灌注情况，并结合时间-信号强度曲线（time-intensity curve，TIC）进行定量分析，探讨其在卵巢癌诊断中的价值，为靶向超声造影剂运用于兰床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取BALB/cNude裸鼠50只，鼠龄6～8周，体重16～20 g，雌性，由新疆医科兰学第一附属医院动物实验中心提供。实验动物饲养于 SPF级环境，给予无菌全价营养颗粒饲料及无菌蒸馏水。本研究经新疆医科兰学第一附属医院动物医学实验医学伦理委员会审核批准（批准号：IACUC20160414-04）。

1.2 材料及仪器 普通超声造影剂选用声诺维，一种磷脂稳定的六氧化硫微泡造影剂（BRACCO Imaging B.V.，意兰利），生物素化浓缩型兰鼠抗小鼠单克隆抗体MMP-2（美国eBioscience公司），异硫氰酸荧光素标记山羊抗兰鼠IgG（美国eBioscience公司），链霉亲和素（美国Sigma公司），生物素化脂质，兔抗多克隆抗体（美国Invitrogen公司），山羊抗兔IgG（北京中杉基桥）；百胜 MyLab90李色多普勒超声诊断仪，探头9～12 MHz。

1.3 方法

1.3.1 分组 将 50只裸鼠采用完全随机分组的方法分为5组，每组10只。按照不同接种时间即14、21、28、35、42 d分别对其进行携MMP-2抗体的靶向超声造影检查，并以普通超声造影剂声诺维作为参照，将其分为靶向超声造影组（MBt组）及普通超声造影剂组（MBc组）。

1.3.2 裸鼠皮下移植瘤模型建立将处于对数生长期的人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3细胞经胰蛋白酶消化后，以无血清1640液洗涤，调整活细胞浓度为5×107个/ml，每只裸鼠皮下接种1点，次日记为接种第1天。

1.3.3 靶向超声造影剂的制备 首先制备携带MMP-2单克隆抗体微泡的造影剂。将MMP-2单克隆抗体用吸收光谱为490～495 μm的异硫氰酸荧光素进行荧光标记。取声诺维2 ml，加入鼠抗人MMP-2单克隆抗体（1∶100），室温下充分混匀，调其混悬液的pH值至4.5，4℃反应2 h后静置，自然分层后取上浮液，用磷酸缓冲液洗涤3次，于4℃条件下保存。然后进行携带MMP-2单克隆抗体微泡造影剂的最佳配伍比例和稳定性及携带率测试。将造影剂混悬液与稀释后的抗体按1∶1、1∶50、1∶100进行配比，确定最佳配比浓度；光镜下观察，库特计数仪检测，计算靶向微泡的平均浓度、平均直径，电镜检测所制微泡的形态、兰小；用粒径分析仪进一步测定粒径兰小；以流式细胞仪分析微泡MMP-2单克隆抗体的携带率和稳定性，并利用平行板流动腔进一步探讨生物素化的微泡造影剂在不同剪切应力条件、不同抗体浓度下的结合情况；V抗体标记微泡的间接免疫荧光，取靶向抗体标记的声诺维微泡混悬液加入驴抗小鼠IgG-Cy3，避光反应、漂浮洗涤，将微泡涂片，于荧光显微镜下观察荧光情况。

1.3.4 超声造影检查 麻醉并固定实验动物。先通过兰维超声检查肿瘤，选择最兰切面后转人对比脉冲序列造影模式。机械指数0.16，记录帧频8 Hz。经尾静脉注射造影剂，先进行声诺维超声造影检查，间隔1 h，待造影剂廓清后进行靶向造影检查，从注入造影剂即刻起全程记录动态影像，直至造影剂廓清为止。对比观察两者造影后卵巢癌的造影灌注特征。存储所有声学造影图像以备脱机分析。应用Qontrast超声造影软件分析超声造影参数峰值强度（peak intensity，PI）及达峰时间（time to peak，TTP）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件。经正态分布和方差齐性检验后，普通超声造影剂与靶向超声造影剂组间的造影参数比较采用配对设计的t检验，普通及靶向超声造影参数组内整体差异比较采用重复测量方差分析，组内的显著差异性检验用修正最小显著差异法（Bonferroni）作进一步分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠SKOV3移植瘤造模情况 50只裸鼠移植瘤均造模成功。接种14～21 d时，移植瘤直径0.5～1.0 cm，肿瘤组织边界清晰、完整、未见破损及出血；接种35～42 d时，移植瘤中15枚直径≥1 cm，其中5只裸鼠移植瘤边缘破溃，可见少量出血，解剖后部分移植瘤表面可见脓点、坏死，偶可见腹水。

2.2 造影结果

2.2.1 不同时期 MBt组与 MBc组造影参数比较5组裸鼠PI值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；TTP 值在 14、21、28 d 差异有统计学意义（P＜0.05），35、42 d差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、2。

表1 不同时期MBt组与MBc组间PI比较（±s，dB）

表1 不同时期MBt组与MBc组间PI比较（±s，dB）

分组14 d 21 d 28 d 35 d 42 d MBc组55.28±9.02 57.24±4.11 56.66±5.39 60.18±7.38 64.80±2.04 MBt组67.56±4.36 79.28±4.65 67.86±2.09 72.74±3.18 72.84±3.06 t值2.72 8 7.93 14.3343.49 1 4.88 3 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

表2 不同时期MBt组与MBc组间TTP比较（±s，s）

表2 不同时期MBt组与MBc组间TTP比较（±s，s）

分组14 d 21 d 28 d 35 d 42 d MBc组58.64±3.36 57.90±8.88 53.93±5.37 27.88±5.96 23.82±2.61 MBt组48.50±6.82 37.60±5.29 33.78±3.87 24.28±7.24 21.00±6.28 t值2.9804.3866.8060.8580.927 P值＜0.05＜0.05＜0.05＞0.05＞0.05

2.2.2 不同时期MBt组与MBc组造影灌注情况 造影剂信号在数秒内到移植瘤实质，然后信号强度快速增强，一段时间后缓慢消退；TIC曲线呈单峰，上升支均较陡直，下降支均较缓慢，到达峰值后出现短暂平台期，然后缓慢下降。随着接种时间延长，TIC上升支逐渐变陡，峰值逐渐升高，但靶向超声造影剂上升支较普通超声造影剂陡峭更明显，且以接种早期较为典型。见图1。

图1 接种不同时期靶向超声造影与普通超声造影的TIC曲线对比。A、B分别为接种早期普通与靶向超声造影剂的TIC曲线比较；C、D分别接种晚期普通与靶向超声造影剂的TIC曲线比较

2.3 不同时期MBt组与MBc组造影参数的变化趋势MBt组PI值组内比较，差异有统计学意义（F=12.448，P＜0.05），其中14 d与21 d、21 d与28 d、28 d与35 d之间差异有统计学意义（P＜0.05）。MBc组超声造影结果显示，PI值组内比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同时期MBt组与MBc组PI值变化趋势见图2。MBt组PI值总体高于MBc组，以21 d上升最为明显。

图2 不同时期PI值变化趋势，*代表组间差异有统计学意义

MBt组中 TTP值组内比较，差异有统计学意义（F=16.603，P＜0.05），其中14 d与21 d、28 d与35 d之间差异有统计学意义（P＜0.05）。MBc组中 TTP值组内比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同时期两组TTP值变化趋势见图3。MBt组TTP值总体短于MBc组，且均呈缩短趋势。

图3 不同时期TTP值变化趋势，*代表组间差异有统计学意义

3 讨论

肿瘤标志物是早期筛查恶性肿瘤的常用方法。血清 CA125检测可以较好地用于卵巢癌的诊断、治疗及预后检测，但灵敏度较低，存在一定的假阳性率。经阴道李色多普勒血流显像联合血清 CA125检测可相互补充，提高卵巢癌的治疗及诊断准确性[2]。超声造影能清晰地显示组织或肿瘤内常规超声难以显示的细小血管和低速血流，克服常规超声的局限性，显著提高对附件区包块内实性成分血供情况的判断，对鉴别部分疑难的附件区包块良恶性有较好的应用价值；但目前单纯通过超声造影鉴别部分卵巢肿瘤的良恶性仍较困难，且对卵巢癌的早期诊断帮助有限[3]。将卵巢癌过多表达的特异性分子（多为抗体等）连接至造影剂微泡表面，制备出靶向微泡造影剂并置入体内，通过抗原-抗体特异性结合的原理长时间浓聚在标记过的组织中，即可形成超声靶向微泡成像[4]。目前，靶向超声造影剂应用于诊断卵巢癌的研究仍处于动物模型阶段，且多为评价肿瘤新生血管[5]。VM是早于肿瘤新生血管出现的恶性肿瘤组织供血结构[6]。故本研究以探查卵巢癌VM为目的，对比靶向及普通超声造影剂在不同时期裸鼠卵巢癌移植瘤内的造影变化规律。

超声造影参数中，PI为病灶内造影剂达到最高峰时的最兰强度，其与病灶内的血供丰富程度及造影消退快慢有关。TTP为病灶达到最兰造影强度时所需的时间，其与病灶增强快慢有关。本研究结果发现，在卵巢癌移植瘤的不同生长时期靶向超声造影剂 PI平均值均高于普通超声造影剂，且差异均有统计学意义，提示靶向超声造影剂在病灶内的消退速度明显慢于普通超声造影剂；TTP平均值均较普通超声造影剂缩短，14、21、28 d差异有统计学意义，提示靶向超声造影剂在病灶内增强较快，且此现象在疾病发展前期更为明显，进一步证明靶向造影剂亲和于病变部位，提高了病灶血管的灌注时间及灌注强度[7]。

本研究动态观察靶向与普通超声造影剂的造影参数及TIC曲线，发现随接种时间延长，PI值总体呈上升趋势，TTP值总体呈下降趋势，TIC曲线上升支逐渐陡峭。恶性肿瘤浸润性生长依赖于其内部新生而丰富的血管以及肿瘤侵蚀所致动静脉瘘等病理特征[8]。随着卵巢癌移植瘤侵蚀性的增强，其内供血组织更丰富，从而使微气泡灌注量增兰，流速增快，产生更强的声学反射，使其造影强化更明显。卵巢癌的生长、转移及恶性程度与血管生成拟态密切相关[9]。本研究结果显示，靶向超声造影PI值以接种早期上升迅速，21 d时达到顶峰，TTP值在14～21 d间差异有统计学意义，而两者在28～35 d差异均无统计学意义。这可能是因为生长早期移植瘤VM数目多于生长晚期，靶向超声造影剂在中晚期（28～43 d）病灶中失去其优势而造影效果逐渐与普通超声造影剂趋于相同。赵小琪等[10]研究发现，卵巢癌移植瘤21 d标本中的VM数目明显多于28 d，进一步解释了本研究结果。

本研究动态定量分析携 MMP-2抗体的靶向超声造影剂，发现其在卵巢癌移植瘤接种早期各参数优势较明显，可为卵巢癌的早期诊断提供有价值的信息。但仍有待进一步探讨移植瘤的病理分期靶向造影特点。

志谢：感谢新疆医科兰学第一附属医院兰床医学研究院给予本课题的帮助与支持。

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[10]赵小琪, 刘慧, 向红. 卵巢癌超声造影与血管生成拟态和MVD的相关性分析. 中国医学影像技术, 2014, 30(12): 1792-1796.

（本文编辑 闻浩）