基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展与挑战

基因组编辑技术是指可以在基因组水平上对DNA序列进行定点改造的遗传操作技术，其在基因功能研究和改造、生物医学和植物遗传改良等方面都具有重大的应用价值。科学家自20世纪90年代末就开始探索基因组定点编辑技术，进入21世纪后，随着蛋白质结构与功能研究的新突破和人工核酸内切酶（EEN）技术的出现，将特异识别并结合DNA的蛋白结构域和EEN融合，创造出能够特异切割DNA序列的核酸酶（SSNs），从而可以对基因组特定位点进行高效和精确的靶向编辑。

图1：SSNs介导的DSBs及其修复途径

一、基因组编辑技术在作物遗传改良上的应用进展

目前，在作物遗传改良上应用的基因组编辑技术主要包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系统三种类型。其中CRISPR/Cas系统包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2等亚类型，但应用最多的是CRISPR/Cas9，而CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2尚无在作物改良上应用的报道。

上述三类基因组编辑技术均能对植物基因组进行精准的定点敲除、插入和替换，对于控制作物重要农艺性状基因的功能鉴定、作物重要性状的遗传改良具有巨大的应用价值。与传统的常规育种相比，基因组编辑技术能直接对目标性状基因进行修饰，大幅度提高了目标性状聚合的精准度，加快了聚合育种的进程。近年来，对该技术的优化及在作物遗传改良上的应用已成为各国农业生物技术研发的重点。

（一）ZFNs技术及其应用

ZFNs技术被称为第一代基因组编辑技术，是一种人工改造而成的核酸内切酶，由锌指蛋白的DNA结合域和核酸内切酶FokI的切割结构域组成。其中，DNA结合域通常由3-6个锌指结构域（Zincfingerdomain，ZFD）串联而成。一个ZFD能特异识别DNA链上3个连续的核苷酸碱基，多个ZFD串联后就能特异识别较长的核苷酸序列。近年来，ZFNs技术已成功应用于人类干细胞、大鼠、果蝇、斑马鱼、拟南芥、烟草和玉米等生物体的基因组编辑。但是ZFNs的构建难度较大，普通分子实验室难以操作，且成本高。

（二）TALENs技术及其应用

TALENs是继ZFNs之后的第二代基因组编辑技术。TALEN的DNA结合域为天然的或经改造的TAL效应子（TALeffector，TALE）蛋白结构域。TALE重复区的每个重复单元能特异识别一个特定的核甘酸碱基，多个重复单元串联后就能特异识别较长的核苷酸序列。与ZFN相比，TALEN载体的构建相对简单、成本更低、普通的分子生物实验室也能操作。此外，TALEN技术基于重复单元与核苷酸碱基一对一的识别模式，特异性更强，靶向编辑的效率更高。

2012年，LI等首次利用TALENs技术对水稻白叶枯病感病基因Os11N3（SWEET14）启动子中的效应蛋白结合元件（effector-bindingelement，EBE）进行定点编辑，有效阻止了水稻白叶枯菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo）分泌的效应蛋白（AvrXa7和PthXo3）与Os11N3启动子结合，使该基因不受Xoo的诱导表达，从而提高了水稻的白叶枯病抗性。2014年，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队利用TALENs技术同时靶向突变小麦MLO，证明TALENs技术能对小麦这样的多倍体植物进行定向遗传改良。

（三）CRISPR/Cas9技术及其应用

CRISPR/Cas是细菌和古细菌抵御病毒和外源DNA入侵的适应性免疫系统。目前，CRISPR/Cas系统可分为两大类。第一大类由多个Cas蛋白组成的复合体行使生物学功能，第二大类由单个Cas蛋白（如Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2）行使生物学功能。CRISPR/Cas9属于II类，仅需要成熟的crRNA（CRISPR-derivedRNA）、tracrRNA（trans-activatingRNA）和Cas9蛋白就能实现对外源DNA的切割。

CRISPR/Cas9系统具有构建简单、编辑效率高、容易实现多基因编辑等优势，利用CRISPR/Cas9技术对控制作物产量、品质相关的负调控基因进行定向修饰，能不同程度地改良作物的产量、品质和株型等，是作物高产优质育种的新途径。此外，通过CRISPR/Cas9技术定点敲除作物抗性负调控因子基因，或定点修饰抗逆性正调控基因的启动子以增强基因的表达，或对抗性相关基因编码区定点替换改变基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育种的有效途径。

LI等利用CRISPR/Cas9技术对水稻产量负调控基因Gn1a（每穗实粒数）、DEP1（直立型密穗）、GS3（粒长和粒重）和IPA1（穗粒数、分蘖相关）进行定点修饰，发现Gn1a或DEP1、GS3突变后水稻的每穗实粒数或着粒密度、粒长都明显增加，但DEP1突变体在着粒密度增加的同时有半矮化现象，而GS3突变体在粒长增加的同时芒也显著增长。中国农业科学院作物科学研究所赵开军团队以稻瘟病感病品种空育131为材料，利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除OsERF922，获得的T2纯合突变系在苗期和分蘖期对稻瘟病菌的抗性相比野生型都有显著提高。SHI等利用CRISPR/Cas9技术，将玉米GOS2启动子定点插入ARGOS8的5′-非翻译区或直接替换ARGOS8的启动子，获得ARGOS8表达量显著增加的突变体。这是目前首次报道利用CRISPR/Cas9技术通过调节靶标基因的表达量来改良作物遗传性状的案例。2016年，华南农业大学生命科学学院庄楚雄团队利用CRISPR/Cas9技术对水稻温敏核雄性不育基因TMS5进行特异性编辑，创制了一批温敏核雄性不育系。

（四）CRISPR/Cpf1技术及其应用

CRISPR/Cpf1隶属于II类typeV-ACRISPR系统，是迄今发现最简单、有效的II类CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cpf1特异切割DNA双链的原理与CRISPR/Cas9相似，但其作用机制不同。Cpf1是Cas蛋白的一种，其功能与Cas9类似，目前AsCpf1（Acidaminococcussp.Cpf1），LbCpf1（LachnospiraceaebacteriumCpf1）和FnCpf1（FrancisellanovicidaCpf1）已被证实具有DNA切割及执行RNA加工的活性。Cpf1蛋白由具有识别sgRNA功能的a-REC区域和具有核酸酶功能的NUC区域构成。a-REC包含REC1和REC22个识别结构域；NUC主要包含RuvC结构域、WED（wedge）结构域、一种推定的核酸酶（Nuc）结构域和PI（PAM-interacting）结构域，其中，Ruv-C和Nuc核酸酶分别负责切割靶DNA的非互补链及互补链的不同位点，由此产生具粘性末端的DSBs。不同于SpCas9（StreptococcuspyogenesCas9），Cpf1仅需一个42-nt的crRNA（3′端有23-nt与靶DNA序列互补），就能对靶DNA双链进行切割。研究证明Cpf1核酸酶在人类细胞中与SpCas9具有相当的切割效率，也证实Cpf1核酸酶在人类细胞中具有高度的特异性。

目前，CRISPR/Cpf1技术已成功应用于烟草、大豆和水稻的基因组编辑。XU等将LpCpf1分别与precrRNA和加长pre-crRNA融合构建了crRNA-Cpf1系统，在水稻中的编辑效率最高可达41.2%。HU等将LpCpf1和crRNA整合开发了CRISPR-Cpf1系统，并利用该系统成功实现水稻内源基因的定点编辑。TANG等针对Cpf1蛋白及crRNA的表达特性，构建了PolII型启动子融合核酶（ribozyme）驱动的Cpf1和crRNA植物表达单元，并成功对水稻内源基因OsPDS、OsDEP1和OsROC5进行定点突变。WANG等将四个DR（directrepeats）-guide单元组成的crRNA分别与FnCpf1和LbCpf1融合构建CRISPR/Cpf1系统，并利用该系统简单、高效地实现了水稻多基因定点编辑。

（五）利用CRISPR/Cas系统在基因组编辑方式上的技术创新

单碱基突变可引起作物许多农艺性状的改变，因此，实施单碱基编辑对作物遗传改良具有十分重要的意义。2016年，中国科学院上海生命科学研究院朱健康团队将APOBEC1通过非结构化的16残基肽XTEN作为接头，融合到Cas9（D10A）的N末端，并将核定位信号（NLS）肽添加到Cas9（D10A）的C末端，构建了APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)植物基因组单碱基编辑系统，利用该系统对水稻NRT1.1B和SLR1进行编辑，结果表明该系统能在靶位点产生预期的C→T（G→A）碱基替换，NRT1.1B和SLR1在靶位点产生预期突变的效率分别为2.7%和13.3%。

二、基因组编辑技术应用于作物改良的基本原则

（一）ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas如何抉择

ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas都是有效的基因组编辑技术，但三者在设计、特异性和效率上各有不同。ZFNs由于特异性不高、脱靶问题严重及获得ZFN蛋白非常困难，严重阻碍了其广泛应用。TALENs的优点是特异高、脱靶效应低，但载体构建较繁琐、编辑效率不是很高、且难以同时对多个基因进行编辑。CRISPR/Cas系统的优点是编辑效率非常高，设计和构建极其简单，但CRISPR/Cas系统的特异性稍差，存在较明显的脱靶效应，另受PAM识别位点限制。

（二）基因敲除还是基因替换？

目前，基因编辑技术应用于作物遗传改良主要有两种方式，一是通过靶向敲除目标性状负调控基因，造成该基因功能缺失，以改良目标性状；二是通过对目标性状控制基因进行定点替换，导致该基因功能发生改变，从而获得新的目标性状。因此，在实践中运用基因组编辑技术对作物进行遗传改良时也要分以下两种情况：一是对于目标性状起负调控作用的基因采取基因敲除的方式，目前，绝大部分基于基因组编辑技术的作物遗传改良都是通过此方式实现的，如水稻稻瘟病抗性的改良、水稻温敏核雄性不育系的创制等；二是对于目标性状的获得是因目标基因突变导致基因功能发生改变的基因，采用基因定点替换的方式，如抗除草剂水稻、玉米等都是通过基因定点替换而获得的。

（三）靶位点如何选择

在作物遗传改良的实际操作中，是敲除多基因还是单基因、靶位点在基因上的位置及数目都是需要考虑的。如果需要同时改良多个目标性状，以及目标性状是由微效多基因或多等位基因控制的情况，最好针对每个目标性状控制基因，或微效多基因等设计多个靶位点进行定向敲除，能最快、最省地获得改良目标性状。如果控制目标性状的是主效基因，则敲除单个基因一般即可达到改良目的。

靶位点在基因上的位置也比较重要，进行基因敲除时，靶位点应优先选择在起始密码子附近，或在特定的功能域（可能引起密码子缺失和移码）；而如果是基因替换，靶位点则需选择在基因特定功能区（突变后基因功能发生改变的区域）。此外，靶位点的数量也关系到定向编辑的效率和遗传转化的规模。

三、基因组编辑技术在作物遗传改良上应用的机遇与挑战

基因组编辑技术从出现至今不过短短十多年时间，但其已广泛应用于生物医学和农业等领域。特别是TALENs和CRISPR/Cas9技术出现后，极大地加快了作物分子育种的研究步伐。目前，CRISPR/Cas技术已成为基因编辑应用的首选，广泛应用于生物和农业领域。

基因编辑技术应用于作物遗传改良，主要是通过定点突变靶标基因，造成基因功能缺失以实现性状改良，故敲除的基因必须都是目标性状负调控基因。但作物许多性状改良都需要获得基因功能，因此，基因组定点替换或插入的基因组编辑具有更广泛的应用前景，而植物细胞中同源重组效率很低，目前植物基因组编辑技术对基因单碱基替换、片段定点插入和替换等编辑的效率还很低。因此，对大部分控制重要农艺性状的正调控基因目前还无法高效、精准地进行编辑，极大地限制了基因编辑技术大规模应用于作物遗传改良的发展。

综上所述，基因编辑技术的出现为作物分子育种提供了新的机遇，但仍然面临政策法规和技术优化两方面的挑战。在植物基因功能研究和作物遗传改良方面，基因编辑技术具有其他分子技术无法比拟的巨大优势和机遇。随着大量作物品种全基因组测序的完成和越来越多重要农艺性状不利基因被发现，基因组编辑技术必将在作物遗传改良和品种培育上发挥巨大的作用。