金钗石斛在SD大鼠体内的药代动力学研究

杜艺玫，张一新，凌 蕾，刘 浩，曾 瑶，李 炯，何芋岐，鲁艳柳，周旭美

(1.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 药学院药学实验室，贵州 遵义 563099)

早在《神农本草经》中就列为上品的名贵补益中药石斛，因其具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳、明目强身等作用，市场需求日益扩大，对其进一步的开发和利用亟待开展。在2015版中国药典中明确规定，石斛的药用植物来源之一是金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)，而其所含生物碱正是其主要的活性成分[1]，具有降血糖[2]、抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗老年痴呆[5- 6]、抑制细胞凋亡[7]、抗白内障[8]、解热、止痛、解毒[9]等现代药理作用。金钗石斛总生物碱主要为倍半萜类生物碱，目前分离得到石斛碱、石斛氨碱、石斛酮碱等总计14种[10]。其中，石斛碱(dendrobine，C16H25O2N)是金钗石斛总生物碱中最主要的特征性成分[6,11-12]，在课题组的前期研究中也发现，石斛碱占金钗石斛总生物碱含量的92%以上[13]，结构如图1。目前对金钗石斛研究报道主要集中在药效学方面，而较少研究其药物代谢动力学。因此，本文将以石斛碱为指标，在课题组前期体外代谢研究的基础上[14]，采用UPLC-MS建立能够快速、灵敏、准确地检测大鼠血浆中石斛碱含量的方法，首次探讨金钗石斛细粉灌胃给药后在大鼠体内药代动力学的特征，为其进一步研究、开发提供参考，并为临床给药方案提供依据。

图1 石斛碱结构

1 材料与方法

1.1 仪器 Thermo Scientific Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统，Thermo Ultrmate 3000 超高效液相色谱系统(美国Thermo Fisher公司)，Genius 1022液氮发生器(英国PEAK公司)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)，XS205电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，XW-80A漩涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，Microfuge 20R高速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)，STW-FT24制冰机(日本三洋公司)。

1.2 实验动物 雄性健康SPF级SD大鼠7只[生产合格证号：SCXK(渝)2012-0005]，由重庆第三军医大实验动物中心提供，体重200～240 g，饲养温度21～22 ℃，湿度56%～65%，明暗交替时间12/12 h。本实验符合遵义医学院实验动物伦理委员会的伦理学标准。

1.3 药品与试剂 金钗石斛药材(批号：ZCXT20160503)购自贵州赤水市信天中药产业开发有限公司。取适量干燥药材粉碎，至全部通过五号筛，且至少95%通过六号筛，即得细粉。精密称取约0.25 g细粉，按照药典石斛项下金钗石斛的提取方法[15]提取，参考前期实验研究方法[16]测定药材中石斛碱的含量，按干燥品计算，含石斛碱0.40%。

石斛碱(批号：D990100)，购自北京华迈科生物技术有限责任公司，质量分数≥99.0%。盐酸伪麻黄碱(批号：171237-201208)，购自中国食品药品检定研究院，质量分数≥99.9%。乙腈、甲醇、甲酸均为质谱级，购自Sigma-Aldrich化学制品有限公司。其它试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂公司。

1.4 方法

1.4.1 UPLC-MS的分析条件 色谱条件：采用Hypersil Gold C18(150 × 2.1 mm，1.9 μm)色谱柱分离；流动相组成为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱条件为0～0.5 min，5% A；0.5～15 min，5%～95% A；15～17 min，95% A；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

质谱条件：采用HESI 离子化方式；雾化温度为300 ℃，离子传输管温度为350 ℃；鞘气流速为35 arb，辅助气流速为15 arb；喷雾电压3.5 kV；m/z检测范围100～1 500；扫描模式为 Full Scan/正离子扫描；分辨率采用 MS Full Scan 70 000 FWHM。

1.4.2 对照品及内标工作液的配制 精密称取石斛碱对照品约15 mg，置于10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度线，混匀，即得对照品储备液，于4 ℃保存备用。待用时精密吸取对照品储备液适量，以乙腈稀释，即得对照品工作液。

精密称取盐酸伪麻黄碱对照品(IS)约10 mg，置于10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度线，混匀，即得内标储备液，于4 ℃保存备用。待用时精密吸取内标储备液适量，以乙腈稀释，即得内标工作液，待用。

1.4.3 标准血浆样品的配制及处理方法 实验当日精密吸取空白血浆100 μL，加入不同浓度的石斛碱对照品工作液20 μL，涡旋30 s，再依次加入内标工作液20 μL和乙腈200 μL，涡旋30 s，即得含石斛碱质量浓度分别为912.94、456.47、91.294、45.647、9.129 4 ng/mL和3.043 ng/mL的标准血浆样品。13 000 rpm离心10 min，取上清50 μL进行UPLC-MS分析。其中以质量浓度912.94、91.294、9.129 4 ng/mL为高、中、低浓度质控血浆样品，质量浓度3.043 ng/mL为定量下限(LLOQ)标准血浆样品，均平行制备5份。

1.4.4 血浆样品的处理方法 精密吸取血浆样品100 μL，加入乙腈20 μL，涡旋30 s，再依次加入内标工作液20 μL和乙腈200 μL，涡旋30 s，13 000 rpm离心10 min，取上清50 μL置进样瓶中，待进行UPLC-MS分析。

1.4.5 大鼠体内药代动力学的研究 7只大鼠实验前12 h禁食不禁水，实验期间自由饮水，实验12 h后进食。按0.8 g/kg剂量灌胃给予金钗石斛细粉(0.5%CMC-Na助悬)，分别于给药后0、2、6、10、15、20、30、40、60、90、120、180、240、480、720、1 440 min经大鼠眼眶静脉丛采血约0.2 mL，置肝素钠化的离心管中，4 500 rpm离心15 min，分离血浆待测。采用生物统计学软件DAS2.1，对大鼠灌胃给药后的时间-血药浓度数据进行非房室模型(统计矩法)计算。

2 结果

2.1 方法的特异性 取7个不同来源的大鼠空白血浆，分别精密吸取空白血浆各100 μL，加入200 μL乙腈，涡旋30 s后，13 000 rpm离心10 min，各取上清50 μL供方法特异性的考察使用。取7个不同来源的大鼠给药后的血浆，按1.4.4项下方法处理得到血浆样品，以UPLC-MS进行分析，结果见图2。测定结果显示,待测成分石斛碱和内标的保留时间分别为7.76、5.96 min，空白血浆在相应时间处没有出峰，表明该血浆处理方法及测定条件具有专属性，血浆中的内源性物质不干扰石斛碱的准确测定。

A：空白血浆；B：血浆样品；1：石斛碱；2：内标。图2 大鼠血浆中石斛碱和内标化合物的选择离子图

2.2 线性和定量下限的考察 将1.4.3项下方法制得的标准血浆样品，以1.4.1项下条件分析后，数据采用加权(1/X2)最小二乘法进行回归运算，以石斛碱与内标的峰面积之比(Y)对应石斛碱质量浓度(X)求得的直线回归方程，Y= -0.675 8 + 0.139 3X(r=0.998 8)。结果表明，在912.94～9.129 4 ng/mL范围内，血浆中石斛碱质量浓度与峰面积的比值呈良好线性关系。血浆中石斛碱的LLOQ为3.043 ng/mL，信噪比率(S/N)大于10。

2.3 基质效应的考察 精密吸取15份来源不同的空白血浆各100 μL，加入200 μL乙腈，涡旋30 s，13 000 rpm离心10 min。分别精密吸取150 μL，加入对照品工作液10 μL，制得低、中、高石斛碱浓度的血浆基质样品。再加入内标工作液10 μL，涡旋30 s，13 000 rpm离心10 min，取上清50 μL进行UPLC-MS分析，石斛碱和内标峰面积分别记作A1和B1。精密吸取15份100 μL水，加入200 μL乙腈，涡旋30 s，13 000 rpm离心10 min，分别取上清150 μL，加入对照品工作液10 μL，制得低、中、高石斛碱浓度的无基质样品。再加入内标工作液10 μL，涡旋30 s，13 000 rpm离心10 min，取上清50 μL进行UPLC-MS分析，石斛碱和内标峰面积分别记作A2和B2。石斛碱基质效应(matrix effect，ME)按公式ME=A1/A2×100%进行计算，内标的基质效应按公式ME=B1/B2×100%进行计算。计算结果显示，石斛碱的基质效应在95.5%～110.2%，RSD 小于6.0%，内标的基质效应为107.1%，RSD 为5.3%，说明血浆对石斛碱和内标化合物不存在基质效应，不影响血浆样品准确定量分析。

2.4 提取回收率的考察 将1.4.3项下方法制得的高、中、低浓度质控血浆样品进行UPLC-MS分析，峰面积分别与基质效应验证实验中A1、B1比较，计算石斛碱和内标的提取回收率。计算结果表明，石斛碱的平均提取回收率为93.6%～109.4%，RSD小于8.7%，内标的平均提取回收率为97.8%，RSD为7.5%。

2.5 精密度和准确度的考察 将1.4.3项下方法制得高、中、低浓度质控血浆样品进行UPLC-MS分析，计算精密度和准确度。计算结果显示，石斛碱和内标化合物的日内精密度RSD%均小于9.1%，日间精密度RSD%均小于10.3%，准确度均在92.5%～104.9%，符合方法学的要求。

2.6 稳定性的考察 将1.4.3项下方法配制高、中、低浓度的质控血浆样品，分别15 ℃放置24 h，-70 ℃保存并反复冻融3次，以及-70 ℃保存15 d后，以UPLC-MS检测，按随行标准曲线，计算样品测得浓度与标识浓度的偏差 (RE%) ，以此考察样品的稳定性。结果显示，石斛碱和内标化合物在上述保存条件下，测得值与标识值的相对偏差均小于11.6%，样品稳定，均能达到测定要求。

2.7 金钗石斛细粉大鼠体内药代动力学的研究 大鼠经灌胃给予金钗石斛细粉后，于不同时间点采集血浆样本，处理后的样品采用建立的UPLC-MS检测方法进行测定，结果显示，给药后2 min 石斛碱已经吸收入血，在给药剂量下石斛碱的时间-浓度曲线(见图3)。应用非房室模型方法(统计矩法)计算药代动力学参数，评价金钗石斛主要成分石斛碱在大鼠体内的药代动力学参数，结果(见表1)。

图3 大鼠灌胃金钗石斛细粉(0.8 g/kg)后石斛碱平均血药浓度-时间曲线(n=7)

表1大鼠灌胃金钗石斛细粉(0.8 g/kg)后石斛碱的药动学参数(n=7)

检测结果t1/2(min)Tmax(min)Cmax(μg/L)AUC(0-t)(μg·min-1/L)AUC(0-∞)(μg·min-1/L)Vz(L/kg)CLzL/(min·kg)MRT(0-t)(min)MRT(0-∞)(min)平均值351.9511.71212.1716573.2117792.4988.110.18288.31403.05RSD(%)21.9520.6718.9213.1716.5815.6116.3018.6120.45

3 讨论

本研究借助已有的文献报道[1-13]，锁定金钗石斛药材主要有效物质成分之一的生物碱，并以其特征代表性成分石斛碱为指标，采用UPLC-MS分析系统，建立了针对大鼠血浆样品进行快速、准确、灵敏的检测方法，并应用于金钗石斛在大鼠体内的药代动力学研究。通过研究发现，SD大鼠口服给药金钗石斛细粉(0.8 g/kg)，以石斛碱为指标考察其药代动力学特征，血浆中石斛碱浓度平均达峰时间为11.71 min，最大血药浓度平均值为212.17 μg/L，平均半衰期为351.95 min。由表观分布容积(Vz= 88.11 L/kg)可以看出，口服金钗石斛细粉后石斛碱在体内具有较广的分布。这一结论与课题组前期考察石斛碱组织分布的实验结果吻合，在心、肝、脾、肺、肾、脑、肠组织中均能发现石斛碱，且在肝脏和肠组织中分布较多。通过考察证明，在相同的检测分析条件下，盐酸伪麻黄碱响应良好，与目标化合物石斛碱保留时间相近且完全分离，无血浆中的内源性物质干扰，基质效应、提取回收率、精密度、准确度和稳定性均满足方法学的要求，可以作为内标化合物。

随着药学研究的发展，药代动力学的研究对于开展药物毒理学研究、新药安全性评价等方面具有重要意义，具备良好的药代动力学性质的药物才能有更好的应用前景。本文仅研究了金钗石斛细粉单次灌胃给药后在大鼠体内的药代动力学特征，将进一步研究其不同给药剂量、不同给药次数、不同给药途径的药物代谢动力学特征，为更好的开发与利用金钗石斛提供实验参考，并为制定临床给药方案提供依据。

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