化妆品刺激性评价方法的研究进展

徐晓明

摘 要：随着经济的快速发展，化妆品行业也迎来了发展高峰期。目前化妆品的种类繁多，其品质也是参差不齐，但是都在一定程度上对皮肤有一定的刺激性。本文综述了目前法规认可的国内外化妆品刺激性评价的体内和体外替代方法，重点从原理、方法、应用等方面介绍了眼睛、皮肤刺激、腐蚀性评价体外替代方法，共包括9种眼刺激、腐蚀性、3种皮肤腐蚀性、1种皮肤刺激性评价方法。最后提出体外替代方法虽然有待进一步成熟，但已经成为全球发展趋势，而我国应结合国情积极建立相应的体外替代方法。

关键词：化妆品；刺激性评价；方法；研究

1前言

刺激性物质作用于机体后可能引发机体产生刺激、过敏等一系列的生理、生化反应，其中最主要的是刺激反应，可导致水肿、红斑、瘙痒、疼痛等症状。包括欧美国家在内的多国化妆品法规均明确规定了化妆品原料和产品应进行相应的眼睛、皮肤的刺激性安全评价。我国《化妆品安全技术规范》（2015版）中“毒理学试验方法”规定，化妆品新原料需进行皮肤和急性眼刺激性、腐蚀性试验，同时化妆品产品在投放市场前，对于每天使用的化妆品需进行多次皮肤刺激性试验；对于间隔1日或数日使用或使用后冲洗的化妆品需进行急性皮肤刺激性试验；使用时可能与眼睛接触的产品需进行急性眼刺激试验。长期以来，皮肤、眼睛刺激性试验主要依赖动物试验，Draize兔眼试验是测定急性眼刺激的国际标准方法，Draize试验也是国际公认的动物皮肤刺激性试验标准。

近年来，以欧盟为首的全球众多国家和地区纷纷呼吁禁止在化妆品安全评价中使用动物试验：欧盟2004年开始禁止化妆品成品动物试验和禁止销售经过动物试验的化妆品成品，2013年3月全面禁止化妆品动物试验并禁止销售经过动物试验的化妆品；新西兰自2015年5月起禁止在化妆品及成分研究、制造、测试和教学中使用动物试验；印度自2014年11月起禁止进口经过动物试验的化妆品等。禁止动物试验在化妆品安全性评价中的使用已成为全球趋势，推动了替代动物试验的体外评价方法的开发和应用。

2眼刺激评价

在某些情况下，眼睛可能成为化妆品及其成分作用的靶器官或吸收途径，从而引起眼刺激、腐蚀，故眼刺激、腐蚀性的评价是化妆品及其成分安全性评价的必要内容。目前，常用的方法有体内和体外替代法，体内方法已使用多年，近几十年对体外替代方法进行了大量的研究与验证。

2.1体内试验方法

兔眼试验在2008年前是测定急性眼刺激的国际标准方法，目前仍是我国化妆品法规中规定的眼刺激性、腐蚀性评价的标准。虽然长期以来，兔眼试验被认为是评估眼刺激性、腐蚀性的唯一标准方法，但该方法试验周期长、成本高，且动物试验结果与人体仍有一定的差异性，其科学性及合理性有待进一步验证。

2.2体外试验方法

至今，已有多种动物替代试验的体外方法被开发和应用。其中已有5种方法得到了OECD的认可，2种经过了ECVAM的验证。

2.2.1牛角膜浑浊和渗透性试验

BCOP法利用离体牛眼角膜，将受试物直接与牛角膜接触，刺激物可导致角膜上皮屏障功能破损和基质蛋白变性，将牛角膜的浑浊度和渗透性作为毒理学的评价指标，根据公式计算与两个指标数值相关的体外刺激分数（InVitroIrritancyScore，IVIS），通过评分进行分类：若IVIS>55，则受试物具有严重眼刺激性，不需要其他方法验证；IVIS≤3，则无刺激性；若3

2.2.2离体鸡眼试验

ICE法利用短期离体培养的鸡眼球进行眼刺激检测。取鸡眼球固定于夹持器，暴露受试物，通过肉眼检查、测量角膜厚度、表面灌流和荧光素渗透评价角膜损伤程度，将角膜膨胀度、角膜浑浊度和荧光素滞留度的数值作为毒理学终点，根据终点数值分别对三个评价维度进行ICE分类，包括I、II、III、IV，最后通过三个评价指标的终点组合分析：（1）若终点组合为3×I、2×I和I×II，则无刺激性；（2）若终点组合为3×IV、2×IV和I×II、2×IV和1×II、2×IV和IV×I、30min时角膜浑浊度≥3（至少两只眼球）、任何时间点角膜浑浊度=4（至少2只眼球）、上皮严重松弛（至少1只眼球），则有严重眼损伤和眼腐蚀；（3）若为其他情况，则无法判断。ICE法可用于鉴别化学物的眼腐蚀和严重眼损伤或无刺激性，但无法区分严重眼刺激、眼损伤。该方法适用于固体、液体、乳剂、凝胶状化合物。

2.2.3荧光素漏出试验

FL法是一项基于细胞毒性和细胞屏障功能的眼刺激替代试验。将受试物暴露后，以导致培养的单、多层细胞20%荧光素漏出的受试物的浓度FL20（mg/ml）作为评价指标，若FL20≤100mg/ml，即可确定受试物可导致眼腐蚀性和严重刺激性。FL法在国外获得了大量的验证研究，OECD指南推荐将FL法用于体外试验“自上而下”分层组合策略中，初步筛选眼腐蚀性、严重刺激性的受试物，但不推荐用于轻微、弱刺激性的评估，以及眼刺激性的分类。FL法仅适用于在规定条件下的水溶性无色物质，不包括强酸、强碱、细胞固定剂、强挥发性物质，会产生凝固、皂化或其他特殊反应的化学物同样不适用。

2.2.4短期暴露试验

引起角膜上皮细胞的细胞毒性是化学物引起角膜上皮损伤和眼刺激的重要作用方式，STE法利用兔眼角膜细胞（SIRC），将受试物短期暴露5min，使用MTT法或CCK-8法测定细胞吸光度，通过计算受试物暴露后引起角膜上皮的细胞生存率判断受试物的眼刺激性。若受试物5%和0.05%质量比浓度引起细胞生存率≤70%，则该受试物有刺激性；反之，若受试物5%和0.05%质量比浓度引起细胞生存率大于70%，则无眼刺激性。

3皮肤刺激、腐蚀性评价

化妆品原料及产品对皮肤的损伤主要包括皮肤刺激性和腐蚀性，皮肤刺激性是指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性损伤，腐蚀性指的是不可逆损伤，体内和体外替代试验是常用的方法，其中体外替代方法正成为趋势。

3.1体内试验

标准动物皮肤刺激性试验是Draize试验，也是国际公认的标准。常规的人体试验是斑贴试验，根据观察志愿者斑贴部位是否有红斑、浸润、水肿、丘疹等临床表现分级并评估。若受试物刺激反应小，人体试验临床表现不明显，为了全面评估受试物的刺激性，可通过生物工程技术进行评价，如通过检测经皮水分流失（TransepidermalWaterLoss，TEWL）评估皮肤屏障功能，TEWL值越大，表明皮肤屏障功能受损越严重。

3.2体外试验

目前已经有多种皮肤刺激、腐蚀性体外替代方法经过了OECD、ECVAM的验证与认可。

人表皮模型主要是将由人体取得的角质形成细胞在体外诱导培养，完全分化至具有多层皮肤结构的三维人体表皮模型。经过验证的主要有EpiSkin、EpiDermTM、SkinEthicTM、LabCyteEPI-MODEL24SIT四种模型，将受试物涂抹于皮肤模型，暴露一定时间后用MTT法测试细胞存活率，若细胞存活率>50%，则该物质对皮肤无刺激；若细胞存活率≤50%，则该物质有皮肤刺激性，但无法对刺激性进一步分类。

4结束语

体外科学技术的发展极大地促进了替代方法的研究开发，世界各国在严禁动物试验和推行替代方法的法规上的认识逐渐统一，虽然目前替代方法的开發和验证有待进一步成熟，如何将具有不同预测能力和使用范围的体外方法科学合理地整合，提高替代方法的准确度、精密度等都是以后的研究重点，但毫无疑问替代方法在化妆品安全性评价中的使用已成为全球趋势。