光能变价离子钛对烟草青枯雷尔氏菌和野火病菌的抑制作用

余佳敏，刘 颖，肖建华，肖 勇，江 鸿，余祥文*

(1.中国烟草总公司四川省公司，四川 成都 610041； 2.西南大学植物保护学院，天然产物农药研究室，重庆 400715；3.湖北中烟工业有限责任公司，湖北 武汉 430040)

烟草青枯病和野火病是烟草生长过程中重要的细菌性病害。其中，青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，以下简称青枯菌)引起的一种土传病害，烟株根、茎、叶均可受害，在我国南方烟区，尤其在广东、福建、湖南、四川和贵州发病严重[1]，带来巨大经济损失。而烟草野火病则由烟草假单胞杆菌属，丁香假单胞烟草致病变种(Pseudomonassyringaepv.tabaci)引起，主要为害烟草叶部，在云南、贵州、四川等省份发生较为普遍[2]。目前对这2种病害的防治仍以化学防治为主，但化学防治导致农药残留、土壤生态环境的破坏等问题越来越突出。因此，探索开发抑制青枯病菌和野火病菌的高效、低毒新药剂具有十分重要的意义。

近年来，钛(Ti)在农作物上的研究越来越广泛，烟草上也做了大量研究。刑小军等[3-5]曾报道钛对烤烟和白肋烟烟株长势和烟叶品质方面有显著作用；焦浈等[6]曾报道低剂量钛离子注入烟草种子可以引起种子发芽率及叶片含钾量提高；张永辉等[7]曾报道钛土肥对烤烟早花有一定的抑制作用。除了在生长发育、产值产量等方面对作物存在影响外，在病害防治方面钛也能起到一定作用。有研究指出，钛对黄瓜霜霉病、白粉病、番茄和玫瑰的细菌性叶斑病的发生有一定的抑制作用[8-10]，对黄瓜细菌性角斑菌、茄假单孢菌、水稻白叶枯菌、娄彻氏霉菌、植物冠瘿瘤致病菌根癌农杆菌等有一定的抑菌效果[11-12]。此外，Goswani等[13]的研究也表明，钛对稻米象有一定的防效。但目前其在烟草病虫害防治方面仍没有相关研究报道。

此外，据报道，与Ti相关的TiO2及光能变价离子钛(TIVL)对多种细菌有良好的杀菌效果[12,14]。基于此，本实验选择TIVL作为处理药剂，以烟草青枯菌和野火病菌作为研究对象，探究钛离子对烟草青枯菌以及野火病菌的抑制作用，为进一步研究离子钛抑制青枯菌和野火病的作用机理奠定基础，同时也为应用离子钛防治烟草青枯病和野火病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

光能变价离子钛(TIVL)，简称离子钛，由钛谷(天津)科技有限公司惠赠，未添加其他金属元素，钛离子母液浓度为4 mg·mL-1。

1.1.2 供试菌种

青枯菌菌株，由西南大学植物保护学院天然产物农药研究室提供，分离自烟草青枯病病株。

野火病菌菌株，由西南大学植物保护学院天然产物农药研究室提供，分离自烟草野火病病株。

1.2 处理设计

1.2.1 供试培养基的准备

NA培养基：葡萄糖10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母浸膏1.0 g，琼脂粉15.0 g，蒸馏水 1 000 mL，调节pH值6.8～7.0，121 ℃灭菌20 min。

B培养基：胰蛋白胨10.0 g，酪朊水解物1.0 g，酵母提取物1.0 g，蒸馏水1 000 mL，在121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 供试菌剂的准备

取保存的青枯菌和野火病菌菌株于NA平板上划线，并置于(30±2)℃培养箱中培养48 h，待长出单菌落后，挑取单菌落于液体B培养基中培养12～16 h，至D600为1.0(≈109mL-1)，离心收集菌体重悬于无菌水中，再以无菌水进行10倍梯度稀释至约103mL-1备用。

1.2.3 平板抑菌试验

用150 mL三角瓶，配制固体NA培养基60 mL·瓶-1。高压灭菌后，冷却至约45 ℃左右，分别添加母液浓度为4 mg·mL-1的离子钛0、120、240、360、480、540 μL，使其终浓度分别为0、8、16、24、32、36 mg·mL-1，未加离子钛(0 mg·mL-1)的培养基为对照。摇匀后倒平板，每60 mL培养基倒3个平板，为3个重复。凝固后，吹干冷凝水，分别添加已备好的103mL-1青枯菌或野火病菌菌株，放入10～20颗灭菌玻璃珠进行涂布。

将各处理放入(30±2)℃培养箱中倒置培养，分别于24、36、48、72和96 h拍照记录实验结果。

1.2.4 MIC和MBC测定

离子钛对青枯菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)的测定是通过在固体培养基上菌株的存活力决定[15]。已熔化的NA培养基冷却至45 ℃左右加入离子钛母液配置成终浓度为0、8、16、24、32、36 mg·L-1的带药培养基，充分混匀后，每皿20 mL，倒入培养皿中制成带药平板。在带药平板上均匀涂布100 μL菌悬液(约105mL-1)，随后放入(30±2)℃培养箱中倒置培养，培养48和96 h后拍照记录实验结果。

1.2.5 生长曲线

在50 mL的无菌的三角瓶中配制0(为空白对照)、16、24、32、36 mg·L-1的带药B培养基，然后在超净工作台中分别于每瓶中加入D600=1.0的菌悬液，混合均匀后最终形成最终菌含量约5×106mL-1的样品，置于(30±2)℃、180 r·min-1的摇床中培养，每隔2 h在无菌条件下取样3 mL，利用紫外分光光度计600 nm检测吸光值，各浓度重复3次。以取样时间为横坐标，总长为24 h，各浓度下菌悬液的光密度值为纵坐标，分别绘制不同浓度离子钛影响下青枯病菌和野火病菌的生长曲线图。

1.2.6 数据分析

在Excel 2010中对数据进行初步整理，用Sigmaplot对数据进行作图。

2 结果与分析

2.1 平板抑菌

利用平板带药法测定不同浓度光能变价离子钛对烟草青枯菌和野火病菌菌落生长的抑制情况。从图1和图2可以看出，离子钛对青枯菌和野火病菌菌落生长的抑制作用具有显著的浓度效应，即随着琼脂平板中添加药剂浓度的升高，对菌落生长的抑制作用也随之增强。随着离子钛浓度增加，菌落生长所需时间越长，菌落个数稍有减少，但是差异不显著。当离子钛浓度为32 mg·L-1时，野火病菌在48 h时即生长出菌落，而青枯菌则培养至96 h才出现菌落；当离子钛浓度为36 mg·L-1时，培养96 h后2种细菌均未长成菌落。说明离子钛对烟草青枯菌和野火病菌均有较好抑制作用。

2.2 MIC和MAC

记录培养48和96 h后病菌在含不同浓度离子钛的培养基中的生长情况，培养48 h后平板上无菌落生长的处理浓度为MIC，96 h后无菌落生长的处理浓度为MBC。从图3和图4可以看出，离子钛对青枯菌的MIC和MBC分别为32 mg·L-1和36 mg·L-1，而对烟草野火病菌的MIC和MBC均为36 mg·L-1。

图1 在含不同浓度光能变价离子钛的培养基中青枯菌的生长状况

图2 在含不同浓度光能变价离子钛的培养基中野火病菌的生长状况

2.3 生长曲线

根据最小抑菌浓度(MIC)设置4个浓度进一步探索光能变价离子钛在不同浓度下对烟草青枯病菌和野火病菌生长的影响，由于野火病菌在32和36 mg·L-1时完全抑制病菌生长，故本文只选择32 mg·L-1及以下的浓度。结果(图5)表明，在24 mg·L-1浓度下，烟草青枯菌和野火病菌生长对数期均被延后，最终生长浓度也低于对照处理；而32 mg·L-1浓度时则完全抑制青枯病菌和野火病菌生长。由此可见，光能变价离子钛随着浓度升高，对烟草青枯病菌和野火病菌的抑制作用增强。

图3 不同浓度光能变价离子钛培养48 h和96 h后对青枯菌菌落的生长影响

图4 不同浓度光能变价离子钛培养48 h和96 h后对野火菌菌落的生长影响

图5 不同浓度光能变价离子钛对青枯病菌(A)和野火病菌(B)生长的影响

3 讨论

烟草是吸食叶片的特殊作物，对农残要求甚高，高毒低效、安全无污染的农药是当前绿色防控的必然趋势。钛对烟草有增产提质作用[3-5]，对多种病菌有抑制作用[8-12,14]，且对环境和生物无害[16]，有望成为替代其他化学产品的新型农药。

本研究开展了烟草青枯菌和野火病菌在不同浓度TIVL中的平板抑菌试验、MIC和MBC测定以及生长曲线试验。结果表明，TIVL对烟草青枯菌和野火病菌均有较好抑制作用，对烟草青枯菌的MIC和MBC为32 mg·L-1和36 mg·L-1，对烟草野火病菌MIC和MBC均为36 mg·L-1，且2种病菌在含有32 mg·L-1TIVL的培养液中均不能生长。本实验初步表明，高浓度TIVL对烟草青枯病和野火病菌有抑制作用，其抑菌浓度分别为32和36 mg·L-1。此结果与范延芬等[12]对青枯病菌雷尔氏菌的研究结果大致一致，但是抑菌浓度稍有差异，可能与青枯病菌原液浓度和培养基不同有关系。虽然没有相关研究开展离子钛与野火病菌的关系，但范延芬等[12]的实验中推测出TIVL具有广谱抑菌效果。Vatansever等[14]开展的研究表明，TiO2对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、霉菌及单细胞藻类均有良好的杀灭效果，与本实验中高浓度的TIVL能抑制野火病菌生长相对应。

虽然高浓度TIVL对烟草青枯病菌和野火病菌有抑制作用，但是其作用机理尚未明确，还需进一步试验探索验证。但TIVL是广谱性抑菌剂，在多种作物上均有较好效果，应用前景良好，人们对用该物质防治病虫害的研究将会日趋完善，这将为TIVL防治病虫害，解决农药污染，提高农产品安全提供新思路。

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