正交试验优化余甘子愈伤组织诱导培养基研究

黄 勇，张 铁，沈尚东

（文山学院，云南 文山 663099）

余甘子（Phyllanthus emblica L.）系大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）乔木。分布于印度、斯里兰卡、中南半岛、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾等，南美也有栽培。我国产于江西、福建、台湾、广东、海南、广西、四川、贵州、云南等南方省（区）。余甘子用途广泛。其根系发达，可保持水土，可作产区荒山荒地酸性土造林的先锋树种。树姿优美，可作庭园风景树，亦可作为果树栽培。果实富含丰富的丙种维生素，供食用，可生津止渴，润肺化痰，治咳嗽、喉痛，解河豚鱼中毒等。初食味酸涩，良久乃甘，故名“余甘子”。树根和叶可供药用，能解热清毒，治皮炎、湿疹、风湿痛等。叶晒干供枕芯用料。种子含油量16%，供制肥皂。树皮、叶、幼果可提制栲胶。木材棕红褐色，坚硬，结构细致，有弹性，耐水湿，供农具和家具用材，又为优良的薪炭柴［1］。

余甘子良种苗木多采用嫁接的方法进行无性繁殖，扦插繁殖不理想［2］。组织培养是植物快速繁殖的最佳途径，但国内外对余甘子组织培养的相关报道很少。Sehgal-CB等［3-4］用胚乳诱导出胚状体，形成三倍体小苗，但小苗移植死亡率较高。Parul等［5］用下胚轴诱导出不定芽，但不定芽生根非常困难。Rahman MM等［6］用茎尖和节间诱导出丛生芽，但丛生芽生根率很低。张守英等［7-8］成功诱导嫩芽、嫩枝形成丛生芽，但生根率和移栽存活率都不高。胡海涛等［9-10］用下胚轴诱导出不定芽，生根率也不高。植物组织培养环节中，愈伤组织诱导至关重要，既可进一步诱导器官分化形成组培苗，又可直接从愈伤组织中提取次生代谢产物。我们通过混合正交设计，以期筛选出余甘子愈伤组织诱导培养基配方，完善余甘子组织培养方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生余甘子种子，购自文山市综合市场。

1.2 研究方法

1.2.1 种子无菌萌发 将余甘子种子冲洗干净，置75%酒精中漂洗30 s，无菌水冲洗3次，1 g/kg HgCl2灭菌10 min，无菌水冲洗5次。接种于1/2 MS+蔗糖25 g/L+琼脂6 g/L，pH为5.8的培养基上，培养在温度为25℃、光照强度为2 000 lx、光周期为12 h条件下。

1.2.2 愈伤组织诱导 种子萌发后，分别取无菌幼苗的根、茎、叶接种到愈伤组织诱导培养基。愈伤组织诱导培养以MS为基本培养基，添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH为5.8。植物生长调节剂采用混合正交设计（表1）。

表1 余甘子愈伤组织诱导混合正交设计

如表1所示，共25个处理，每处理接种12瓶，每瓶接种3～4个外植体。置温度为25℃、光照强度为2 000 lx、光周期为12 h培养室中培养。观察外植体生长情况。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织生长情况

不同外植体在不同培养基中的生长情况有所差异，有的未形成愈伤组织。形成愈伤组织的情况如表2所示。

表2 余甘子愈伤组织生长情况

从愈伤组织产生速度和颜色来看，茎和叶是诱导余甘子形成愈伤组织较好的外植体（图1），而根的效果不佳。

图1 余甘子叶（左）和茎（右）愈伤组织生长情况

2.2 愈伤组织诱导率极差分析

各处理愈伤组织诱导率有较大差异，结果如表3所示。

从表3极差的R大小可以看出，2，4-D＞外植体＞6-BA，说明对诱导余甘子形成愈伤组织影响最大的因素是2，4-D，其次是外植体，然后是6-BA。

从表3均值K的大小可以看出，对于6-BA来说，均值K从大到小依次为K3、K4、K1、K2、K5，说明随着6-BA质量浓度的增加，余甘子愈伤组织诱导率总体表现为先升高后降低的趋势，最佳质量浓度为0.50 mg/L；对于2，4-D来说，不添加2，4-D未能诱导出愈伤组织，均值K从大到小依次为 K3、K4、K5、K2、K1，表明随着 2，4-D质量浓度的增加，余甘子愈伤组织诱导率表现为先升高后降低的趋势，最佳质量浓度为1.00 mg/L；对于外植体来说，均值K从大到小依次为K2、K3、K1，即茎的愈伤组织诱导率最高、叶次之、根最低，说明应选用茎或叶作为诱导余甘子愈伤组织的外植体。

2.3 愈伤组织诱导率方差分析

运用SPSS软件对影响余甘子愈伤组织诱导率的因素进行显著性检验，结果见表4。

表3 余甘子愈伤组织诱导极差分析

表4 余甘子愈伤组织诱导率显著性检验①

从表4可以看出，6-BA、2，4-D、外植体三者的Sig值均为0，小于0.01，表明6-BA、2，4-D、外植体对余甘子愈伤组织诱导率均具有极显著的影响。

3 小结与讨论

以余甘子无菌幼苗作为试验材料，通过正交试验研究余甘子愈伤组织诱导影响因素。结果表明，以茎或叶作为外植体，在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA培养基中，愈伤组织诱导率达87.9%以上，愈伤组织生长良好。

愈伤组织诱导是植物组织培养过程中的关键环节，诱导率的高低受很多因素的影响。一是外植体的选择。从本试验结果看，茎和叶是较好的外植体。二是激素的质量浓度和组合。一般而言，适宜质量浓度的生长素是决定因素，而适宜质量浓度的细胞分裂素有一定的促进作用。

参考文献

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第四十四卷（第一分册）［M］.北京：科学出版社，1994：87.

［2］崔永忠，陈玉德，郑德蓉.余甘子繁殖试验初报［J］.林业科学研究， 1997， 10（1）： 93-95.

［3］SEHGAL C B， SUNILIA K.Morphogenesis and plant regeneration from cultured endosperm of Emblica officinalis Gaertn［J］.Plant Cell Reports.1985.4（ 5）： 263-266.

［4］SEHGAL C B， SUNILIA K， SYED A N， et al.In vitro regeneration of triploid plantlets from the endosperm of Emblica officinalis Gaertn［J］.Advances in Agricultural Research in India， 1994（ 2）： 1-19.

［5］PARUL G， VIDYA P， KANT U.In vitro shoot differentiation in Emblica officinalis Gaertn［J］.Journal of Phytological Research， 1997， 7（ 2）： 171-172.

［6］RAHMAN M M， ROY P K， ROY S K.Clonal Propagation of Emblica officinalis through in vitro culture［J］.Plant Tissue Culture， 1999， 9（ 1）： 32-35.

［7］张守英，姚小华，任华东，等.余甘子离体快速繁殖技术的初步研究［J］. 林业科学研究， 2002， 15（1）：116-119.

［8］张守英，姚小华，任华东，等.余甘子丛生芽诱导和快速繁殖研究［J］. 经济林研究， 2002， 20（1）： 11-13.

［9］胡海涛，刘永立，姚小华.余甘子下胚轴离体培养中的器官形成与植株再生［J］.果树学报，2006，23（4）：623-626.

［10］胡海涛.余甘子高效再生体系的建立及遗传转化条件的研究［D］.杭州：浙江大学，2006.