检测蓝耳病病毒的双抗体夹心ELISA方法研究

张芷宁/辽宁省锦州市农业信息中心

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪与育肥猪的呼吸困难为特征的一种传染病。

目前PRRSV的诊断方法主要有:病毒分离（VI），RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）等方法。病毒分离耗时长：RT-PCR及IPMA对操作条件及人员有很高的要求，并且费用较高，均不适合在现地推广。

针对现地中检测PRRSV的情况，我们开展了建立双抗体夹心ELISA检测PRRSV的研究，以抗PRRSV的兔多抗为捕获抗体，抗PRRSV的N蛋白的单克隆抗体3D6为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA方法。并与RT-PCR方法在检测现地样品时进行了比较分析，具备较好的敏感性、特异性及重复性。

一、材料与方法

1．材料。

（1）抗PRRSV的N蛋白单抗3D6及抗PRRSV的兔多抗由哈药集团生物疫苗有限公司保存。

（2）ProteinG 和ProteinA试剂盒购自GE公司。

2．方法。

（1）抗体制备。将保存的单抗3D6及抗PRRSV的兔多抗分别用GE公司的ProteinG和ProteinA试剂盒进行抗体纯化，并用BCA Protein Assay kit对抗体浓度进行测定。按照测定结果，将单抗3D6用PBS的浓度调节为3ug/ml，用pH9.6的碳酸盐溶液调节抗PRRSV的兔多抗的浓度为5ug/ml。

（2）ELISA方法。①将用pH9.6的碳酸盐溶液稀释后的抗PRRSV兔多抗包被，每孔加入100μl，置4℃过夜，弃去孔中液体。②用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。③加入待检测样品和不含病毒的空白对照，37℃孵育1h。④弃去孔中液体，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。⑤加入调节好浓度的抗PRRSV的N蛋白的单抗3D6加入孔中，3ug/ml，每孔 100ul，37℃孵育 1h。⑥弃去孔中液体，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。⑦加入酶标抗鼠抗体，37℃孵育40min。⑧弃去孔中液体，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。⑨加入TMB（四甲基联苯胺）显色液，每孔 100ul，置 37℃避光放置 15min ；最后加入 2mol/l的H2SO4终止反应，测定OD450值。

二、结果判断

根据对30份PRRSV阴性血清的结果，其均值为0.098，标准差为0.014，得到其阴阳界限值为0.14，因此取OD450≥0.2作为阳性的判定标准。

三、方法评价

1.敏感性试验。将TCID50为107.0的PRRSV阳性样品进行梯度稀释，检出的最低浓度定为该方法的灵敏度。

表1 与RT-PCR比较检测阳性样品的敏感性结果

2.重复性及特异性试验。应用该方法对20份阳性病料及10份阴性病料及5份病毒细胞培养物进行重复，每次间隔时间为一周，共进行6次重复，结果均无差异，说明该方法具有良好的重复性。

应用该方法对猪的其他病毒病进行了特异性检测，该方法对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪胃肠炎病毒、猪流行性腹泻及猪瘟的检测均为阴性，证明该方法具有良好的特异性。

四、结果

应用本研究建立的双抗体夹心ELISA方法，具有良好的灵敏性和重复性及特异性。

检测采集自黑龙江、吉林省5个大中型猪场猪只的组织脏器、全血样品共计128份。并和RT-PCR方法进行了比较，敏感性略低于RT-PCR方法，

表2 与RT-PCR比较检测病料的敏感性结果

五、结论

利用该方法对现地样品进行检测，方法简便，具有较好的敏感性和重复性，且无交叉反应。方法制备简单，成本低，对现地人员的操作要求较低，适合在现地进行推广。