前列腺癌细胞miR-191-5p表达变化及其对细胞增殖和凋亡的影响

张冲，杨鹏，刘振湘，吕蔡

(中南大学湘雅医学院附属海口医院，海口570208)

微小RNA(miRNA)是一类长度为20～24个核苷酸的非编码小分子RNA，主要在转录后水平通过促进靶mRNA降解或抑制其翻译而发挥负性调控作用。大量研究表明，miRNA作为关键调控分子，可通过调控肿瘤细胞的多种生物学过程参与前列腺癌的发生、发展[1]。研究发现，miR-191-5p作为原癌基因，在肝癌、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤组织中表达上调，可通过调控肿瘤细胞的增殖、凋亡等发挥促癌作用[2～7]。有研究发现，miR-191-5p在前列腺癌组织中表达上调[8,9]，但其在前列腺癌发生、发展中的作用鲜见报道。2016年3～12月，本研究观察了miR-191-5p在不同前列腺癌细胞中的表达变化及miR-191-5p敲低对前列腺癌细胞PC-3增殖和凋亡的影响，现分析结果并探讨其在前列腺癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人前列腺癌细胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮细胞RWPE-1均购自中国科学院上海细胞库。miR-191-5p inhibitor及 NC inhibitor均购自上海吉玛制药技术有限公司；RNA提取试剂TRIzol和转染试剂Lipofectamine RNAi max均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；反转录试剂盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit和实时荧光定量PCR SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒均购自日本TaKaRa公司；CCK-8试剂和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司；DMEM培养液、胎牛血清及青霉素-链霉素双抗溶液均购自美国Hyclone公司；胰酶购自美国Sigma公司。

1.2 前列腺癌细胞与正常前列腺上皮细胞miR-191-5p表达检测 采用qRT-PCR法。将人前列腺癌细胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮细胞RWPE-1接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。采用TRIzol试剂提取人前列腺癌细胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮细胞RWPE-1的总RNA，使用反转录试剂盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit和实时荧光定量PCR SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行qRT-PCR反应。PCR反应体系共20 μL：2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，miRNA特异引物和通用下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应采用两步法：95 ℃预变性10 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸30 s共40个循环。miR-191-5p特异引物：5′-CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG-3′，以U6为内参，使用ABI7500 Fast 进行qRT-PCR反应和数据收集。采用2-ΔΔCt法计算各细胞中miR-191-5p相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 miR-191-5p敲低及其对PC-3细胞增殖、细胞周期比例、细胞凋亡影响的观察

1.3.1 miR-191-5p敲低 将PC-3细胞接种于6孔板中，每孔1×106个，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中过夜。待细胞融合30%～50%时，随机分为敲低组和对照组，参照Lipofectamine RNAi max试剂说明书分别转染miR-191-5p inhibitor、NC inhibitor。转染48 h，采用qRT-PCR法检测两组miR-191-5p相对表达量，具体步骤参照1.2。实验重复3次，取平均值。

1.3.2 miR-191-5p敲低后细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。两组转染24 h，收集细胞，加入完全培养液重悬，以3 000个/孔接种于96孔板。两组各设置5行，每行5个复孔，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。分别于培养6、24、48、72、96 h时，加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h。酶标仪450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值。以OD450值表示细胞增殖能力。实验重复3次，取平均值。

1.3.3 miR-191-5p敲低后细胞周期比例观察 采用流式细胞术。两组转染24 h，收集细胞，以1×106个/孔接种于6孔板中，用预冷的70%乙醇于4 ℃条件下固定过夜，PBS洗涤，用含50 μg/mL碘化丙啶(PI)、100 μg/ mL RNase A和0.2%(v/v)Triton X-100的染色液避光处理30 min，上流式细胞仪检测细胞周期，采用FlowJo软件分析各周期细胞比例。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 miR-191-5p敲低后细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。两组转染24 h，收集细胞，以1×106个/孔接种于6孔板中，用预冷的PBS洗涤2次，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀。室温避光孵育15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后置于冰上，1 h内上流式细胞仪检测凋亡细胞比例。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 前列腺癌细胞与正常前列腺上皮细胞miR-191-5p表达比较 前列腺癌细胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮细胞RWPE-1中miR-191-5p相对表达量分别为5.790±0.299、4.550±0.664、2.790±0.145、1.000±0.038，前列腺癌细胞PC-3、LNCap、DU145中miR-191-5p相对表达量均高于正常前列腺上皮细胞RWPE-1(P均<0.01)。

2.2 敲低组与对照组miR-191-5p表达比较 敲低组与对照组miR-191-5p相对表达量分别为0.27±0.09、1.00±0.02，敲低组明显低于对照组(P<0.01)。

2.3 敲低组与对照组细胞增殖能力比较 敲低组与对照组转染24 h再培养6 h时细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)，敲低组转染24 h再培养24、48、72、96 h时细胞增殖能力均低于对照组(P<0.05或<0.01)。见表1。

表1 敲低组与对照组转染24 h再培养6、24、48、72、96 h细胞增殖能力比较

注：与对照组同时间比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 敲低组与对照组细胞周期比例比较 敲低组G0/G1期细胞比例高于对照组，S期细胞比例低于对照组(P<0.05或<0.01)；两组G2/M期细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 敲低组与对照组细胞周期比例比较

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.5 敲低组与对照组细胞凋亡比例比较 敲低组与对照组细胞凋亡比例分别为(16.67±0.97)%、(9.27±0.85)%，两组比较P<0.01。

3 讨论

研究发现，有多种miRNA在肿瘤组织和肿瘤细胞中异常表达，发挥癌基因或抑癌基因作用，作为重要的调控因子参与肿瘤的发生、发展[10～13]。如miR-191-5p在肝癌、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞中表达升高，并可通过调控肿瘤细胞增殖、凋亡等发挥促癌作用[2～6]；miR-191-5p可作为肝细胞癌治疗的潜在靶点，抑制其表达可降低肝癌细胞的增殖活性并诱导其凋亡，继而抑制肿瘤生长[2]。肝癌组织中miR-191-5p基因组位点由于处于低甲基化状态，导致miR-191-5p表达升高，进而促进肝癌细胞的上皮间质转化[3]。肾细胞癌患者血清miR-191-5p表达较健康者明显升高，提示血清miR-191-5p可作为肾细胞癌早期诊断的潜在标志物[4]；miR-191-5p联合miR-125b、miR-21用于区分乳腺癌组织和癌旁正常组织具有较高的敏感性和特异性[5]。miR-191-5p过表达可通过降低caspase 3/7活性和SOX4、p53表达，进而抑制乳腺癌细胞凋亡[14]；miR-191-5p在肝内胆管细胞癌组织中表达上调，且其表达上调是患者预后不良的一个独立危险因素，过表达miR-191-5p可促进肝内胆管细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移[15]；miR-191-5p可通过作用其靶基因TET1，提高p53基因转录起始位点的甲基化水平，进而降低p53表达。

Volinia等[9]采用基因芯片技术对前列腺癌组织及其癌旁正常组织miRNA表达谱进行分析，发现miR-191-5p在前列腺癌组织中表达升高。本研究结果显示，人前列腺癌细胞PC-3、LNCap、DU145中miR-191-5p相对表达量均高于正常前列腺上皮细胞RWPE-1，表明miR-191-5p可能是前列腺癌发生的一个原癌基因。本研究利用miR-191-5p inhibitor敲低了PC-3细胞中miR-191-5p表达，并对其细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡进行检测。结果显示，敲低miR-191-5p表达能够抑制PC-3细胞增殖活性，并将其阻滞于G0/G1期，还能诱导PC-3细胞凋亡。说明前列腺癌细胞miR-191-5p高表达与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关，其可能通过调控细胞增殖和凋亡参与前列腺癌的发生、发展，是一个具有原癌基因作用的miRNA。

综上所述，miR-191-5p在前列腺癌细胞中表达升高；敲低miR-191-5p表达可抑制前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡。

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