覆盆子多酚的提取工艺及体外抗氧化活性研究

王蘇音，金 清

(延边大学,吉林 延吉 133002)

覆盆子是蔷薇科悬钩子属木本植物,主要含有菇类、黄酮、氨基酸、维生素E等成分。近年来研究表明覆盆子具有抗肿瘤、抗衰老、抗癌、抗淋巴细胞增殖等多种生理功能[1]。覆盆子中黄酮类化合物具有清除自由基、抗血小板凝集的作用，并能显著提高红细胞超氧化物歧化酶活性[2]；覆盆子中水杨酸具有促进尿酸排泄，缓解痛风的疗效[1]；覆盆子中鞣化酸抑制癌细胞的生长[3]。

多酚类化合物是是高等植物代谢过程中的次级代谢产物，具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌、抗动脉硬化、抗痛风及心脑血管疾病等生理作用[4]。目前国内外研究主要集中在覆盆子黄酮类成分鉴定以及提高免疫力、改善心绞痛等方面，对覆盆子多酚类物质的提取工艺及体外抗氧化活性研究鲜见报道。因此，本研究以乙醇热回流法对覆盆子多酚类化合物进行提取，采用正交实验优化覆盆子多酚的提取工艺，并考察其体外抗氧化能力，评价覆盆子多酚在抗氧化方面的作用，为覆盆子多酚在功能食品、药品中的应用及产品开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

覆盆子采购于吉林大药房，鉴定为蔷薇科悬钩子属木本植物的干燥果实，挑选饱满干净无虫蛀的干燥果实备用。

没食子酸标准品(货号CAS：149-91-7) 上海哈灵生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

Sorvall Evolotion RC型高速冷冻离心机 美国Thermo公司；Cary 300紫外可见分光光度计 美国Varian公司；HZQ-Q型电热恒温培养箱 上海一恒实验设备有限公司；722分光光度计 上海光谱仪器有限公司；XW-80A涡旋混合器 上海精科实业有限公司。

1.2 覆盆子多酚的提取

1.2.1标准曲线的制备

分别精确吸取没食子酸标准品储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL定容至10 mL，稀释成不同质量浓度的没食子酸标准品应用液。按照福林-酚法[5]，取1 mL标准品应用液，依次加入5 mL蒸馏水和1 mL Folin-Denis试剂，充分混匀，静置5～8 min后，再加入7.5%(质量分数)的碳酸钠溶液3 mL，震荡摇匀后静置2 h。在765 nm波长处测定各浓度标准品光密度值。以没食子酸标准品质量浓度(mg/mL)为横坐标(X)、光密度值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，线性回归方程为Y=0.083+4.231X，R2=0.999 7。

1.2.2覆盆子多酚含量的测定

精确称取向覆盆子多酚提取物10.00 mg，定容至25 mL。准确量取10 mL，分别定容25 mL，依次加入5 mL蒸馏水和1 mL Folin-Denis试剂，充分混匀，静置5～8 min后，再加入7.5%(质量分数)的碳酸钠溶液3 mL，震荡摇匀后静置2 h。在765 nm波长处测定各浓度标准品光密度值。根据回归方程计算覆盆子多酚提取物中覆盆子多酚质量浓度(以没食子酸计)。

1.2.3单因素实验设计

分别采用40%、50%、60%、70%(体积分数)的乙醇溶液，提取温度85 ℃，料液比1∶20，提取2次，每次提取1 h，研究乙醇体积分数对覆盆子多酚提取得率的影响。采用最佳体积分数乙醇，提取温度分别为50、60、70、80 ℃，料液比1∶20，提取2次，每次提取1 h，研究提取温度对覆盆子多酚提取得率的影响。采用最佳体积分数乙醇，最佳提取温度，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，提取2次，每次提取1 h，研究液料比对覆盆子多酚提取得率的影响。采用最佳体积分数乙醇，最佳提取温度，最佳料液比，提取时间分别为1、2、3、4 h，提取2次，研究提取时间对覆盆子多酚提取得率的影响。采用最佳体积分数乙醇，最佳提取温度，最佳料液比，提取次数分别为1、2、3、4，每次提取2 h，研究提取次数对覆盆子多酚提取得率的影响。

1.2.4正交实验设计

根据单因素实验结果，以覆盆子多酚提取得率为评价指标，选取对覆盆子多酚影响效果最明显的因素：乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时间，采用四水平三因素，以覆盆子干果粉末为原料进行正交实验，每个实验重复3次，确定覆盆子多酚提取的最佳工艺条件。因素水平表见表1。

表 1 正交实验因素水平

1.3 覆盆子多酚的体外抗氧化作用

1.3.1对DPPH自由基清除能力的测定

取样品溶液2.0 mL加入浓度为0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液2.0 mL，充分混匀，于室温避光静置反应30 min，4000 r/min离心(4 ℃)10 min，取上清液检测517 nm处吸光度值。选用维生素C溶液为阳性对照，含DPPH的无水乙醇溶液为空白对照。覆计算盆子多酚对DPPH自由基的清除率[6]。

1.3.2对ABTS自由基清除能力测定

浓度为7 mmol/L的ABTS溶液和浓度为2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液按体积比1∶1充分混匀后，室温避光条件下反应16 h得到ABTS自由基母液。使用时ABTS+·溶液用80%乙醇稀释，并调整其在734 nm处的吸光度值为0.700±0.030。取样品溶液1 mL与5 mL ABTS+·溶液充分混匀，室温下静置反应6 min，4000 r/min离心(4 ℃)10 min，取上清液在734 nm处测定吸光度值。选用维生素C溶液为阳性对照，去离子水代替样品作为对照，80%乙醇溶液作为空白对照。计算覆盆子多酚对ABTS的清除率[7]。

1.3.3对超氧化物阴离子清除能力测定

取0.05 mol/L Tirs-HCl缓冲液(pH=8.2)5 mL，置于25 ℃水浴预热20 min，加入样品溶液2 mL，并添加25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，置于25 ℃水浴反应5 min后，加入0.5 mL HCl终止反应，6000 r/min离心(4 ℃)10 min，取上清液在320 nm处测定吸光度。维生素C溶液为阳性对照，以0.1 mol/L HCl代替邻苯三酚溶液作对照，以0.05 mol/L Tirs-HCl缓冲液作为空白对照。计算覆盆子多酚对超氧化物阴离子的清除率。

1.3.4铁离子螯合能力测定

取样品溶液2 mL与浓度为2 mmol/L的FeCl2溶液0.10 mL充分混匀，室温静置反应5 min后，分别加入5 mmol/L的菲咯嗪0.4 mL及蒸馏水5.50 mL，充分振荡混匀，室温下静置反应10 min，6000 r/min离心(4 ℃)10min。取上清液于562 nm处测定吸光度值。EDTA作为阳性对照。计算覆盆子多酚对铁离子的螯合能力。

1.4 统计学分析

正交实验所得结果由SPSS 22.0软件分析，根据覆盆子多酚提取率确定因素水平的优劣，选出最佳提取工艺。体外抗氧化实验数据采用SPSS 19.0软件进行处理，实验结果均以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，不同组间的比较采用方差分析比较。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1乙醇体积分数对多酚提取得率的影响

多酚类成分极性较大，溶剂提取法常采用乙醇回流提取法，易于多酚类成分的溶出。结果随着乙醇体积分数的增加，覆盆子多酚提取得率呈现增加后减少的趋势。当乙醇体积分数由40%增加到60%，覆盆子多酚提取得率明显增加，乙醇体积分数为50%时多酚提取得率基本趋于稳定，当乙醇体积分数为60%，覆盆子多酚提取得率达到最大值26.73 mg/g，随着乙醇体积分数的增加，多酚提取得率降低至27.21 mg/g。在实际操作中考虑总多酚的充分溶出和试剂成本，选择体积分数为50%的乙醇进行提取。

2.1.2提取温度对多酚提取得率的影响

多酚类成分结构不稳定受热，选择50、60、70、80 ℃进行提取。结果随着温度的升高，覆盆子多酚提取得率几乎呈线性增加。当温度升高到70 ℃，覆盆子多酚提取得率达到最大值32.53 mg/g，当温度升高到80 ℃，多酚得率显著下降，但仍然高于50 ℃时的多酚得率。提取温度升高可以促进分子热运动，提高覆盆子多酚的溶出率，但温度过高会导致多酚类成分的氧化和分解，因此提取温度选定为70 ℃。

2.1.3料液比对多酚提取得率的影响

结果表明随50%(体积分数)乙醇溶剂量的增加，覆盆子多酚提取得率明显增大，在料液比1∶20时覆盆子多酚提取得率基本趋于稳定，随着料液比的增加，多酚提取得率增加较为缓慢，增加的乙醇溶液并没有明显的促进多酚的溶出率，对覆盆子多酚提取得率增加量较小。在实际操作中考虑多酚的充分溶出，同时也为避免溶剂的浪费，从提取得率、溶剂用量和生产成本等角度综合考虑，固液比选择为1∶20(g/mL)时提取效果好。

2.1.4提取时间对多酚提取得率的影响

结果表明随着提取时间的增加，覆盆子多酚提取得率呈现增加后降低的变化趋势。在1～3 h随着提取时间的延长，覆盆子多酚提取得率逐渐增加。当提取时间为2 h时，多酚提取得率为40.53 mg/g，提取时间继续延长，覆盆子多酚提取得率缓慢下降。考虑到浸提时间越长，多酚类成分易因高温提取条件而发生氧化分解，因此提取时间选择2 h。

2.1.5提取次数对多酚提取得率的影响

结果表明随着提取次数的增加，覆盆子多酚提取得率逐渐增加。当提取2 次后，多酚提取得率随提取次数的增加上升幅度缓慢，这可能是由于随着提取次数的增加覆盆子中多酚已基本溶出。考虑提取次数过多会给后续的滤液浓缩带来困难，从简化实验操作和节省时间考虑，确定提取次数选择2次。

2.2 正交试验结果

由表2可知，4个因素对覆盆子多酚提取得率的影响顺序为B>A>C>D，即提取温度>乙醇体积分数>料液比>提取次数，其中提取温度和乙醇体积分数因素对向覆盆子多酚提取得率具有显著影响。根据正交实验结果分析，得出乙醇体积分数为50%，提取温度70 ℃，料液比为1∶20，提取时间2 h。3次重复实验，覆盆子多酚提取得率为42.845 mg/g。

表 2 正交试验结果

2.3 体外抗氧化实验

2.3.1DPPH自由基清除作用

结果表明，不同浓度的覆盆子多酚表现出不同程度的抗氧化活性，随着质量浓度的增加，覆盆子多酚对DPPH自由基的清除能力逐渐增加。其中当覆盆子多酚浓度达到2 g/L时，对DPPH自由基的清除达到74.34%，浓度增加到4 g/L自由基的清除率能达到91%以上，但覆盆子多酚类化合物对DPPH自由基的清除能力略弱于维生素C。结果表明覆盆子多酚类化合物对DPPH自由基有良好的清除能力。

2.3.2ABTS自由基清除作用

随着质量浓度的增加，覆盆子多酚对ABTS自由基的清除率呈线性增加。当覆盆子多酚质量浓度为2 g/L时，对ABTS自由基的清除达到61.02%，浓度增加到4 g/L自由基的清除率能达到87%以上，但覆盆子多酚类化合物对ABTS自由基的清除能力略弱于维生素C。结果表明覆盆子多酚类化合物对ABTS自由基有良好的清除能力。

2.3.3超氧化物阴离子清除作用

结果表明覆盆子多酚对超氧化物阴离子清除能力不及阳性对照维生素C，对超氧化物阴离子清除率随着覆盆子多酚质量浓度的增加缓慢增强，当质量浓度增加到4 g/L，对超氧化物阴离子清除率最高达到43.80%。结果表明覆盆子多酚类化合物对超氧化物阴离子有一定的清除能力。

2.3.4铁离子螯合能力

随着浓度的增加，覆盆子多酚对铁离子螯合能力几乎呈线性增加。当覆盆子多酚浓度为2 g/L时，对铁离子螯合能力达到56.37%，浓度增加到4 g/L对铁离子螯合能力能达到88%以上，但覆盆子多酚类化合物对铁离子螯合能力略小于维生素C。表明覆盆子多酚类化合物对铁离子有良好的螯合能力。

3 结 论

本研究采用正交实验考察提取条件对覆盆子多酚提取得率的影响，影响提取得率的因素次序为：提取温度>乙醇体积分数>料液比>提取次数，确定了最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数为50%，提取温度70 ℃，料液比为1∶20，提取时间2 h，覆盆子多酚提取得率为42.845 mg/g。体外抗氧化能力测试结果表明，覆盆子多酚质量浓度为4 g/L时，对DPPH自由基的清除率为91.34%，对ABTS自由基的清除率为87.26%，对超氧化物阴离子清除率为43.80%，对铁离子螯合能力能为88.12%，说明覆盆子多酚具有很强的抗氧化活性，为深入分析其活性以及进一步开发覆盆子功能性食品提供理论依据。

参考文献：

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