不同抗冻剂对鸡精液冷冻保存效果的影响

孟宪珺

摘 要：本试验精液来自罗曼种公鸡，以6种抗冻剂组合：10%乙二醇（Ethylene Clycol，EG）+5%二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（胞内抗冻剂组合）、5% EG+10% DMSO（胞内抗冻剂组合）、5%甘油+4%蔗糖（胞内外抗冻剂混合组合）、10%甘油+4%蔗糖（胞内外抗冻剂混合组合）、5%蔗糖+10%聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）（胞外抗冻剂组合）和10%蔗糖+5% PEG（胞外抗冻剂组合）以及基础液配成A1、A2、A3、A4、A5和A6六种冷冻稀释液，进行冷冻保存。结果表明，6种稀释液平均精子冻后活率依次为0. 600±0.183、0.600±0.082、0.400±0.083、0.370±0.171、0.100±0.000和0.225±0.150。A1、A2、A3、A4的冻后活率极显著高于A5、A6（P<0.01）;其余各组合之间均差异不显著（P>0.05）。

关键词：鸡精液;精子活率;抗冻剂;冻后活率

中图分类号：S 831.4

文献标志码：A

文章编号：1001-0769（2018）10-0064-02

随着科学技术的发展和研究手段的不断完善，动物人工授精技术已成为家畜家禽改良的重要手段，而精液冷冻保存在人工授精中起着重要作用。目前，已有许多资料表明抗冻剂对牛、马等一些大家畜精液有保护作用。在家禽方面，Polge在1951年第1次用冷冻精液获得孵化小鸡，Ohara等和Schramm等认为用冷冻精液输精的受精率高于鸡自然交配的受精率。还有不少学者的试验结果表明冷冻精液的受精率低于新鲜精液。我国虽有家禽冷冻精液方面的研究，但仍处于试验阶段，并未能在生产中推广运用，主要原因是鸡精子抗冻能力较差，冷冻后精子活率太低。故本试验旨在探讨不同抗冻剂对鸡精液冷冻保存效果的影响。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物

试验动物为体质健康、精液品质优良的罗曼种公鸡。种公鸡饲养于同一鸡舍内，采用二阶梯单笼饲养。整个试验期内自由采食和饮水，日喂1次（9：00～10： 00），自由饮水，鸡舍温度保持在20℃～25℃，湿度为50%～68%。

基础日粮组成：玉米751.40 g/kg，豆粕98.10 g/kg，麸皮84.00 g/kg，沸石粉3.00 g/kg，硫酸锰0. 30 g/kg，磷酸氢钙18.50 g/kg，石粉35.00 g/kg，食盐3.0 g/kg，米糠2.59 g/kg，硫酸亚铁0.26 g/kg，亚硒酸钠0.08 g/kg，赖氨酸1. 10 g/kg，蛋氨酸1.30 g/kg，硫酸铜0.22 g/kg，氯化胆碱0. 88 g/kg，牧乐维他0.29 g/kg;营养水平及含量：钙10.0 g/kg，粗蛋白116.8 g/kg，代谢能12.3 MJ/kg，总磷6.5 g/kg，有效磷4.2 g/kg，可消化蛋氨酸3.1 g/kg，可消化赖氨酸5.8 g/kg。

1.1.2试剂

分析纯化学试剂主要有果糖、磷酸二氢钾、蔗糖、磷酸氢二钠、二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide， DMSO）、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）、乙二醇（Ethylene Glycol，EG）、卵黄、醋酸、龙胆紫和蒸馏水等。

1.1.3主要仪器

电子分析天平、生物显微镜、电热恒温水浴锅、普通温度计、酸度计、容量瓶、渗透压仪、普通冰箱、液氮罐和移液器等（表1）。

1.2方法

1.2.1精液采集

采用背腹按摩法采集精液，将采得的鸡精液用纱布过滤，注意在采集中减少粪便、血液、尿酸盐等的污染。然后将集精瓶用毛巾包好迅速带回实验室，运送过程中，尽量避免震荡，防止阳光直射。采集到的原精混合后活率要求在80%以上方可用于冷冻试验。

1.2.2稀释液的配制

稀释液配方是根据鸡精液特性，从营养物质选择、渗透压、pH、缓冲能力等方面进行考虑并确定用量。按配方准确称取所用试剂，用蒸馏水溶解，滤纸过滤，定容至100 mL，100℃水浴加热消毒30 min，室温冷却后封蜡，阴凉处保存备用。基础液（I液）用果糖9. 002 g、蔗糖17. 114 g、磷酸二氢钾0.461 g、磷酸氢二钠0. 783 g配制成渗透压512 mOsm、pH为6. 74的溶液。冷冻液（II液）以基础液（Ⅰ液）中加入6种不同抗冻剂组合，胞内抗冻剂（10% EG+5%DMSO、5% EG+10% DMSO）、胞内外抗冻剂（5%甘油+4%蔗糖、10%甘油+4%蔗糖）、胞外抗冻剂（5%蔗糖+ 10%PEG、10%蔗糖+5%PEG）配成Al、A2、A3、A4、A5、A6溶液。

1.2.3精液的稀释与平衡

精液采集后以0.2 mL剂量分装于青霉素小瓶，以同温度冷冻液与精液1：1的比例稀释，加入卵黄，用棉花包裹放入冰箱内缓慢降温到4℃～5℃，平衡1 h。

1.2.4冷冻

用吸管吸取平衡后的精液滴于用液氮（- 196℃）冷却到- 80℃～- 120℃左右的铜网的表面，制成小冷冻颗粒（每个颗粒大小为0.1 mL）。滴冻要求快速、均匀，滴冻结束应使精液颗粒停留2 min～5 min，待颗粒由黄变白，即可将铜网浸入液氮。

1.2.5解冻

解冻采用温水解冻法（干解冻），温水解冻法是将1～2个颗粒冷冻精液置于薄壁小试管中，在40℃水浴中不停地摇动观察，待颗粒大部分（75%左右）融解时，将小试管从水浴中取出，然后将小试管底部握在手中（以体温防止解冻不完全或解冻过度烫死精子）并不停摇动直至完全融化。镜检冻后精子活率，并做好记录。

1.2.6活率检查

精液冷冻前，制片置于400倍显微镜下观察精液的原精活力并记录;解冻后，继续将解冻后的精液制片置于显微镜下观察冻后活率。视全部精子为直线运行定为1.0，50%的精子呈直线运行定为0.5，10%的精子呈直线运行定为0.1，按此依次类推。

1.2.7数据分析

试验数据用sPss软件进行方差分析。差异显著时，用Tukey法进行多重比较。

2结果与分析

2.1冻后活率

各组合冻后活率见表2。

由表2可以看出，A1、A2、A3和A4的冻后活率极显著高于A5和A6（P<0.01）;其余Al、A2与A3、A4;A3、A4与A5、A6之间冻后均差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

冷冻保护剂依其渗透性的不同可以分为胞内（渗透性）抗冻剂和胞外（非渗透性）抗冻剂。本试验选用DMSO、EG和甘油3种渗透性抗冻剂和蔗糖、PEG两种非渗透性抗冻劑，以研究不同抗冻剂对鸡精子的冷冻保护作用。试验结果表明，A1、A2、A3和A4的冻后活率极显著高于A5和A6（P<0.01）;这是由于EG、DMSO和甘油为胞内抗冻剂，渗透性抗冻剂部分是通过进入细胞取代细胞内水分，这种取代使细胞脱水或结合细胞水，以阻止细胞内冰晶形成，使水处于过冷状态，降低危险区的上限，缩小危险温区的范围。渗透性抗冻剂不仅对细胞内部，且对原生质膜也有保护作用。而蔗糖和PEG为胞外抗冻剂，不能进入细胞取代细胞内水分，使精子不能像胞内抗冻剂进行保护，使精子的活率低于胞内抗冻剂的精子活率。并且各种抗冻剂虽能在冷冻过程中起到保护精子的作用，但又有毒害作用，使精子的活率明显比冻前活率降低，这也是影响冷冻效果的一个原因。

4结论

胞内抗冻剂比胞外抗冻剂的冻后活率高，故在生产实践中，建议采用胞内抗冻剂和胞外抗冻剂混合组合，既可以满足冻后活率大，也可使精子形态保持完整。