利用SRAP分子标记分析杧果种质遗传多样性

罗世杏 唐玉娟 黄国弟 宋恩亮

摘  要  利用SRAP分子标记技术对来自12个国家或地区的54份杧果种质进行了遗传多样性分析，并对SRAP标记在杧果研究中的效率做了探讨。结果表明，SRAP标记在杧果种质中具有丰富的多态性，引物多态性条带百分比在79.31%～100%，平均为93.10%;引物的有效等位基因数（N_e）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）平均值分别为1.73、0.41、0.60和0.87，表明SRAP标记具有较高的多态性检测效率。基于SRAP标记计算获得的遗传相似系数对杧果种质做聚类分析，54份杧果种质可被划分为3个类群。主成分分析与聚类分析反映的种质亲缘关系基本一致。

关键词  杧果;序列相关扩增多态性;遗传多样性;聚类分析;主成分分析中图分类号  S667.7      文献标识码  A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.007

杧果为著名热带水果之一，因其果肉细腻，风味独特，深受人们喜爱，素有“热带果王”之誉称。我国杧果栽培已有1 300多年历史。经适栽培地区有广西、广东、海南、四川、云南、台湾等省区。目前广西壮族自治区杧果种植面积已居全国各种植省区的首位，但杧果种质资源研究手段相对落后，传统的自然杂交、田间选育等育种手段的广泛使用导致杧果杂交亲本选配上仍存在很大的盲目性，限制现有杧果种质资源的有效利用。随着植物遗传连锁图谱的构建、指纹图谱的绘制、种质资源的遗传多样性研究、基因定位等分子生物学方法^[1-3]的广泛应用，从分子水平上为评估不同种质间的遗传多样性提供了技术支持，借助分子生物学的手段辅助选择育种，为广西现有杧果种质资源研究创新利用提供新的思路，提高育种效率。近年來，ISSR标记^[4]、AFLP标记^[5]、SRAP标记^[6]、SSR标记^[7]及SCoT标记^[8]均已应用于杧果遗传多样性方面的研究，但前人借助SRAP分子标记手段进行杧果遗传多样性分析的供试材料数量少，来源不够广泛，系统性和代表性不足，不利于广西杧果种质资源的挖掘和利用。

SRAP标记是一种基于PCR的标记技术，具有简单、可靠、中通量率以及高百分率的片段来自编码区的特点。SRAP标记主要用于生物多样性的分类鉴定、遗传图谱的构建、重要性状基因标记、基因克隆和杂种优势利用等^[9-11]，SRAP技术的独特引物设计，在具备了RFLP、RAPD、SSR、AFLP等分子标记优点的同时还弥补了其存在的缺陷^[12]，在育种目标性状的评价方面优于其他标记方法，目前已广泛应用于香蕉、苹果、荔枝等园艺作物^[13-18]的遗传多样性分析，是一个评价遗传多样性、品种鉴定的有效工具^[8]。本研究在前期的研究^[19]基础上采用SRAP标记进一步对来自12个国家和地区的54份杧果种质进行较为系统的亲缘关系探究和遗传多样性分析，为有效整理分类广西杧果种质资源、保护和利用现有种质提供理论支持，为今后杧果育种的亲本选配提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

54份杧果种质资源来自世界上12个不同国家和地区（表1），由国家杧果种质资源保护广西创新基地提供。

1.2  方法

1.2.1  DNA提取  每份材料随机采集10片杧果嫩叶，采用CATB法提取杧果嫩叶的基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA质量和浓度，–20 ℃保存备用。

1.2.2  SRAP标记检测  选择栽培地域远、表型差异大的5份杧果DNA作模板，用144对引物进行PCR扩增（表2），筛选出扩增条带清晰、多态性高的引物32对。SRAP-PCR扩增参照赵英等^[16]的方法，PCR扩增体系为：94 ℃预变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，5个循环;94 ℃预变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。扩增产物用7.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并拍照记录。

1.3  数据分析

每个样品的扩增电泳带型按有（1）和无（0）记录，建立分子数据矩阵，不同胶板以DNA电泳分子量标准、特征带和公共带对应，找到对应条带。利用NTSYS 2.10软件通过非加权平均法（UPMGA）计算杧果种质间的遗传相似系数，并在此基础上作聚类分析及主成分分析。采用POPGENE 32软件估算SRAP分子标记的主要遗传多样性参数：引物扩增总条带数（TNB）、多态性条带数（NPB）、多态性条带百分比（PPB）、有效等位基因数（N_e）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）。

2  结果与分析

2.1  SRAP-PCR引物的筛选与扩增结果多态性分析

SRAP正反向引物各12条，两两组合成144个引物组合，用5个地域来源远、表型差异大的杧果试材对引物组合进行筛选，最终选出32个扩增条带清晰并且重复性和多态性良好的引物组合，引物组合me1-em5扩增结果如图1所示。

利用32对引物组合对54份杧果试材进行扩增，具体扩增结果汇总于表3。从表3可以看出，共扩增出898条清晰可见的条带，其中多态性条带836条，平均每对引物扩增条带数为28.06条，多态性比率（PPB）为93.10%;单对引物扩增出来的总条带数差异较大，每对引物组合扩增出的条带数和多态性条带数分别为16～37条和16～36条不等;多态性条带百分比在不同引物间也有较大差异，其分布在79.31%～100%。有效等位基因数N_e的变异范围为1.52～1.96，平均为1.73;Neis基因多样性指数H分布在0.33～0.49，均值为0.41;Shannons信息指数I介于0.51～0.68，平均值为0.60;多态性信息含量（PIC）主要变化范围在0.80～0.92，其均值为0.87。结合这些引物的综合表现，SRAP标记对杧果种质资源具有较强的鉴别能力，适合于杧果遗传多样性关系研究。

2.2  不同杧果种质聚类分析

基于SRAP标记的扩增结果，用NTSYS 2.10软件计算杧果试材资源间的遗传相似系数（GS），构建了54份杧果种质的遗传聚类分析图（图2）。从图2可知，在遗传相似系数0.695的位置大致可将54份杧果种质资源划分为3个大类群，其中第I类群包括的杧果种质数量最多，主要是国内各省区的杧果种质资源，为29个，占总数的53.70%;第II类群包括9个杧果种质，来自于缅甸、泰国、印度等东南亚国家，说明这些地区的杧果种质可能具有较为相似的遗传背景;除了南逗迈4号外，美国、澳大利亚和越南的杧果种质组成了第III类群，南逗迈4号芒分在了第III类群可能是因为其遗传背景较为复杂。而越南杧果种质的遗传关系研究报道较少，现有资料中无法得知其亲本的遗传背景，还需进一步探究其与美国、澳大利亚聚为一类的原因。从图2还能清楚地看出，在相似系数以0.72为截值时，可将第I类群分为3个亚类群。第I亚类群除了矮芒外，其余种质均来自于广西各地的杧果种质，这一亚类群的13份杧果资源相关系数在0.725以上;第II亚类群绝大多数来自于云南，与四川金龙芒聚为一类，这与黄丽芳等^[7]的研究分类基本一致。这可能是因为金龙芒是龙眼香芒与三年芒杂交获得的植株。第III亚类混合了四川、海南、广东、台湾的杧果种质，共有8份资源，这一亚类中存在相关系数为1的情况，如乳芒和龙眼香芒，这可能是因为乳芒是龙眼香芒的实生后代。第II类群的杧果种质主要由印度、缅甸和泰国的杧果种质组成。

2.3  杧果种质的主成分分析

基于SRAP标记数据对54份杧果种质做了主成分分析形成平面图（图3）。前3个主坐标所能解释的相关性分别为0.21%、0.18%和0.26%。图3中不同杧果种质位置距离的远近反映了其亲缘关系的密切程度，种质间距离越近，说明遗传关系越近，远离则说明亲缘关系较远。利用主成分分析对54份杧果种质进行分类，共得到5个主要类群（A、B、C、D和E類群）。其中A群分布在第1象限，B类群主要分布在第1和第3象限，C类群主要分布在第2象限，D类群分布在第2、第3和第4象限，E类群分布在第4象限。这与UPGMA聚类结果相似，A、B和C类群相当于UPGMA聚类中的第I类群的三个亚类，D类群和E类群分别相当于第II和第III类群。云南矮芒距离广西杧果群较云南杧果群更近，因此将其与广西杧果种质归为一类，这与UPGMA聚类结果一致。第II类群中的贵妃芒在主成分分析中归入D类群，可能是因为贵妃是白象牙与凯特的杂交后代。E类群中的海豹杧交错在第1象限中，可能是因为海豹芒是来自印度尼西亚的杧果种质资源，其遗传背景较为复杂。比较图2和图3可以看出，系统分类法和主成分分类法所得的分类结果基本一致，主成分分析结果能够对聚类结果进行直观解释和侧证。

3  讨论

3.1  杧果种质SRAP标记的多态性和有效性分析

序列相关扩增多态性（SRAP）是一个基于PCR的标记技术，具有多态性高、重复性好、较易对扩增得到的目的片段进行测序的特点，正向引物和反向引物两两结合的方式可以通过少量的引物得到多对引物对，从而提高引物的使用效率。本研究用32对引物对54份供试材料进行SRAP扩增，扩增出898条DNA条带，平均多态性条带百分比为93.10%，远高于赵英等^[6]利用22对SRAP引物组合对12份杧果种质资源进行遗传多样性研究的结果，这可能是因为本研究收集的供试材料数量更为丰富，并且采用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染等实验手段，分辨率更高。石胜友等^[20]研究获得的总扩增条带数、多态性条带数位、多态性条带百分比明显低于本研究的SRAP分子标记。黄丽芳等^[7]和Luo等^[8]分别采用SSR和SCoT分子标记手段，其所获得的扩增条带数及多态性信息含量均低于本研究。本研究还对扩增产物在杧果种质多态性方面进行了较为系统的评价分析，共参考了扩增条带总数（TNB）、多态性条带数（NPB）、多态性条带百分比（PPB）、有效等位基因数（N_e）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons（I）和多态性信息含量（PIC）共7个参数。在PPB方面，有7对引物组合基因组扩增条带的多样性达到了100%，平均多态性条带百分比为93.10%，说明SRAP标记在杧果基因组中具有丰富的多态性。N_e、H、I作为SRAP引物多态性评价的重要参数，在本研究中表现良好，其平均值分别达到了1.73、0.41和0.60。作为评价分子标记多态性的重要指标，本研究中的PIC均值为0.87，远大于0.5，说明本研究筛选所得的引物组合为高度多态性信息引物。较于前人利用分子标记手段所得的数据，综合本研究结果，评判后可说明SRAP在杧果种质中具有更高的鉴别能力，更能提供杧果种质差异的遗传信息。

3.2  杧果种质资源的遗传多样性分析

杧果种质资源的遗传多样性分析有助于了解种质间的亲缘远近，便于开展种质创新及新品种选育工作。本研究利用SRAP标记技术对来自不同国家和地区的杧果种质遗传多样性进行了较为系统的分析，分析结果显示，杧果种质资源间的遗传变异系数均值为0.706 5，说明杧果种质资源的遗传多样性水平较高，这与前人研究结果相同^[4]。从本研究SRAP扩增结果来看，54份杧果种质大致可分为3个群组，而I类群中的广东、海南、四川和台湾杧果种质与广西杧果种质分属不同亚类，这与黄丽芳等^[7]将广东、海南和广西杧果种质分属同一类群不同，可能是因为本研究所采用的杧果种质试材和种质数量与其不同，而这对遗传多样性水平有较大的影响。

了解杧果种质资源的遗传变异信息及亲缘关系，是有目的地选配亲本、培育优良品种的基本手段和方法。本研究采用的2种分析方法所得的杧果种质遗传关系的聚类情况与其种质来源和生态区有较高的相关性，说明分子标记分析基本支持以生态型和品种来源划分杧果品种，这与前人研究^[21]的结论基本一致。聚类分析和主成分分析结果显示，国内的杧果种质资源可分为3组群，大多数种质间的遗传相似系数在0.72～0.83，而且遗传变异度小，这可能与基础育种材料的频繁利用有关，说明国内杧果种质的杂交亲本遗传差异不够丰富，其遗传基础较为狭窄。因此，在进行杧果新品种选育时，应加大发掘和利用国外优良杧果种质资源力度，注重选择遗传差异大的亲本杂交，拓宽国内杧果的遗传基础，提高杧果种质资源利用率和育种效率。

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