好氧反硝化菌及其在污水处理和环境修复中的研究进展

丁钰 张婷月 黄民生 何岩 曹承进

摘要：好氧反硝化菌由于其可以进行同步硝化反硝化的独特优势，给传统生物脱氮带来了新思路.本文综述了好氧反硝化菌的分离方法、种类及其影响因素，从电子传递瓶颈理论和酶学理论两方面探讨了好氧反硝化作用机理，介绍了它们在污水处理和环境修复方面的应用.研究表明，温度、溶解氧（DO）、碳源、碳氮比和pH值对好氧反硝化过程影响明显，且好氧反硝化菌在适宜条件下都有高效的脱氮效率.不过，目前好氧反硝化菌在環境修复应用方面仍有着效果不稳定等不足，和实验室研究有着一定的差距，需要进一步的探究.系统总结了好氧反硝化菌的分离方法、种类、反应机理、影响因素以及污水处理和环境修复中的应用。

关键词：好氧反硝化菌;生物脱氮;环境生物修复

中图分类号：X522 文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1000-5641.2018.06.001

引言

污水中含有过量的氮素，导致水体富营养化进而影响水资源利用和水生态安全，所以减少污水中氮排放量，降低水中氮含量是必要的传统生物脱氮方法认为生物脱氮由硝化作用和反硝化作用组成，两个部分相互独立又要协同完成，每一部分所参与的微生物和环境条件完全不同，硝化反应需要自养细菌在好氧条件下完成，反硝化反应需要异养细菌在严格缺氧/厌氧条件下完成.

反硝化是氮素生物地球化学循环的重要环节.长期以来厌养反硝化细菌曾被认为是反硝化过程的唯一承担者.然而，自1980年以来，随着Meiberg等在Hyphomicrobium x氧化二甲胺/三甲胺过程发现具有好氧反硝化功能的菌株以及Robertson等在废水脱硫和反硝化系统中首次分离出一株好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha（现名脱氮副球菌Paracoccusdenitrificans）越来越多的证据表明好氧反硝化菌在生态系统氮素循环中起着不容忽视的作用而且一部分好氧反硝化菌有同步硝化反硝化功能给传统生物脱氮带来了新的思路.本文系统总结了好氧反硝化菌的分离方法、反应机理、影响因素以及污水处理和环境修复中的应用.

1好氧反硝化菌的分离

好氧反硝化菌为专性或兼性好氧细菌，在自然界中含量少，很难成为自然环境中优势菌种，给好氧反硝化菌的分离带来了极大的难度.好氧反硝化菌的分离方法主要有以下几种.

1.1持续曝气法

在细菌的反硝化过程中，硝酸盐（NO-3）和氧气（02）都能作为电子传递过程中电子的最终受体，好氧反硝化菌可以同时利用NO-q和O2.利用该特征，持续往以硝酸盐为单一氮源的反硝化培养基中通入氧气，使细菌处于好氧环境中，氧分子抑制了厌氧条件下发挥作用的酶，使得专性厌氧菌和兼性厌氧菌生命活动受到抑制，从而使好氧反硝化菌在竞争中处于优势地位.Honda等人利用持续曝气法在培养基中曝气一段时间，筛选出一株肠球菌，该菌株可以在有氧条件下进行反硝化脱氮但是这种方法具有筛选时间长、不易于筛选出单一纯化菌种的缺点。

1.2呼吸抑制剂法

呼吸抑制剂法通过在持续曝气的培养基中加入呼吸抑制剂来筛选出好氧反硝化菌.该方法用持续曝气来抑制厌氧和兼性厌氧菌的生长，通过加入某种可以阻断电子流向其他电子受体的呼吸抑制剂，使电子流向氧气和硝酸盐，来抑制其他好氧菌，从而分离出好氧反硝化菌孔庆鑫等选择氰化钾（KCN）作为呼吸抑制剂对富集源进行初筛，之后复筛，筛选出一株高效菌Y2-1，在呼吸抑制法中，选择合适的呼吸抑制剂是该方法的关键，由于菌种培养的不同阶段需要的呼吸抑制剂和不同分离源所需要的呼吸抑制剂都可能不同，给分离过程带来了极大的不便.

1.3酸碱指示剂法

酸碱指示剂法是通过在培养基中加入酸碱指示剂反映出菌株生命活动过程中pH变化，来筛选出特定产酸或者产碱的菌.通常应用于筛选好氧反硝化菌的酸碱指示剂是溴百里酚蓝（BTB），BTB的pH变色范围是6.0～7.6，颜色由黄色到绿色到蓝色.该方法就是利用细菌在反硝化过程中pH值会升高的特点，在好氧条件下用加入了BTB的培养基培养细菌，好氧反硝化菌会在其周围产生一圈蓝色光晕，从而将其分离出李秀婷等人用BTB培养基从污水处理池的活性污泥中初筛出22株好氧反硝化菌株.

1.4滴加试剂法

该方法是利用在培养液中滴加格里斯试剂、二苯胺试剂和奈氏试剂，3种指示剂分别能指示亚硝氮、硝氮和氨氮的变化，从而分离出脱氮效率高的反硝化菌株.开始时在以硝氮为唯一氮源的培养基中加入1-2滴格里斯试剂，可以检测亚硝酸盐的存在，如溶液立即变成棕色或粉红色，说明该溶液中具有好氧反硝化作用的细菌，过程中生成了亚硝酸盐.若无颜色变化，再加X-苯胺试剂，若培养液变为蓝色，则说明硝酸盐并没有被还原，溶液中无反硝化细菌;若无色，则表示硝酸盐和刚生成的亚硝酸盐都被还原成氮氧化物，说明该溶液中具有较强好氧反硝化功能的细菌.周立祥等在好氧条件下采用滴加试剂法，从土壤中分离到3株好氧反硝化菌，均属于假单胞菌属.朱晓宇等采用该方法，分别从水稻土和活性污泥中分离到1株好氧反硝化菌（zW23和ZW27），经鉴定分别为假单胞菌属类产碱杆菌和假单胞菌属门多萨菌，脱氮速率分别达到约21.72和22.31mg/（L.h）.不过这种方法适合筛选反硝化过程中有明显亚硝酸盐积累的菌株，不具有普遍适用性，且在分离精度上有较大的误差.

1.5固液交替培养法

该方法是将液体培养基培养和固体培养基筛选结合，进行多次筛选，不断地划线分离纯化，再通过好氧环境培养，分离出需要的好氧反硝化菌株，再纯化再培养，然后通过测其硝氮去除率来筛选出具有较高脱氮效率的纯种好氧反硝化菌株.此方法可以筛选出高效的纯菌株，但过程复杂，重复操作多，工作量较大.

以上各方法都有一定的缺陷，现在实验中多采用各方法组合的综合筛选法，可以较快地找到高效目标单菌株.Yao等人用BTB培养基在好氧环境中经过固液交替培养分离纯化得到了一株在低温下具有好氧反硝化功能的菌株不动杆菌HA2.黄廷林等用选择培养基通过持续曝气法和逐步驯化培养法从贫营养水源水库中分离出一株好氧反硝化菌A14.

2好氧反硝化菌的种类

好氧反硝化菌的研究从20世纪80年代开始，之后国内外研究者在好氧反硝化领域进行了长期的深入研究，越来越多的新型好氧反硝化菌从自然环境和污水处理系统中分离出来（见表1）.从表1可以看出，很多菌属都具有好氧反硝化能力，例如副球菌属（Paracoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacters）和芽孢杆菌属（Bacillus）.从近些年国内外的研究报道可以看出，虽然在自然环境中，好氧反硝化菌不是优势菌，但使用合适方法可以进行分离和富集。

3好氧反硝化反应机理

3.1电子传递瓶颈理论

Robertson等在废水脱硫和反硝化系统中首次分离出一株好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha（现名脱氮副球菌Paracoccus denitrificans），随后提出电子传递瓶颈理论来解释好氧反硝化反应机理.他们把研究重点放在细菌的电子传递上，对于传统反硝化细菌的电子传递而言，在细胞色素c（Cyt c）和细胞色素aa3（cyt aa3）传递中存在传递瓶颈，从而使电子不能同时流向O2和NO-3，而在好氧反硝化过程中，打破了这种瓶颈，使电子可以同时流向O2和NO-3.从而解除了O2对反硝化过程的竞争抑制作用，可以在好氧环境中进行反硝化过程.

随后，Kong等提出了新的好氧反硝化电子传递模型，认为可能存在一条新的电子传递链，该电子传递链可以以醌氢类为电子供体，通过不受氧气抑制的硝酸盐还原酶（Nar）和亚硝酸盐还原酶（Nir）将电子传递给硝酸盐，从而可以在好氧条件下把硝酸盐还原.该发现补充和发展了Robertson等人的电子传递理论.

3.2酶学理论

研究者们尝试从好氧反硝化酶系统来解释好氧反硝化现象，提出了酶学理论.微生物进行反硝化过程需要4种酶：硝酸盐还原酶（Nar）、亚硝酸盐还原酶（Nir）、一氧化氮还原酶（Nor）和一氧化二氮还原酶（Nos），其中硝酸盐还原酶（Nar）包含两种：膜结合硝酸盐还原酶（M-Nar）及周质硝酸盐还原酶（P-Nar）.前者和细胞膜结合，而后者存在于细胞质膜和细胞壁之间.Bell等将分离得到的好氧反硝化菌T.pantotropha分别在好氧条件和缺氧条件下培养，对两种酶进行研究.结果发现膜结合硝酸盐还原酶（M-Nar）只在缺氧或厌氧条件下表达，而周质硝酸盐还原酶（P-Nar）在好氧和缺氧、厌氧条件下均可以表达，其中好氧条件更适宜该酶的表达.实验证明了正是硝酸盐还原酶的种类差异导致了好氧反硝化菌和普通反硝化菌的区别，好氧反硝化的发生是由于周质硝酸盐还原酶（P-Nar）的存在和表达.

和厌氧反硝化菌不同，好氧反硝化菌拥有两种硝酸盐还原酶，使02和NOi可以同时被还原，o2对好氧反硝化过程不再起到竞争抑制作用，好氧反硝化得以实现.

4好氧反硝化的影响因素

好氧反硝化菌由于其独特的优势而被广泛关注，目前对好氧反硝化的研究还处于实验室阶段，人们从自然界中分离出多种好氧反硝化菌，但是由于该类菌对环境要求苛刻及其特殊性，研究好氧反硝化的影响因素及其优化条件对优化好氧反硝化系统设计及其工程应用显得尤为重要.

一般来说，影响好氧反硝化的因素有温度、溶解氧、碳源、碳氮比和pH值等，这些因素都是影响好氧反硝化菌生长及其反应速率的重要因素.其中，温度是影响所有微生物生长、繁殖及其生理活性的重要因素，有机碳源种类和浓度会影响好氧反硝化的反应速率，在一定范围内碳源浓度的升高会加快好氧反硝化的速率，pH值通过影响酶活性来影响好氧反硝化速率，这些因素对于不同菌种的影响程度不同.

4.1温度

过高和过低温度都会抑制好氧反硝化过程，对于大多数好氧反硝化菌，最适温度范围为25～37°c.Ren等发现对于好氧反硝化菌Acinetobacter sp.YB而言，在37°c下获得的NH+4-N去除率最高，微生物的生长速率也随着温度的升高而升高.但也有特殊情况，一些好氧反硝化菌就不受低温的影响.在已经发现的好氧反硝化菌中，也有少数被证明是嗜低温菌.Yao等发现一株异养硝化一好氧反硝化菌在温度低至10°c时仍能保持相对高的生长速率，没有滞后阶段，且20°c为最适生长温度.从表2可以看出大多数好氧反硝化菌在较宽的温度范围内（25～37°c）保持着较高的活性和脱氮效率，这有利于好氧反硝化菌在环境中的竞争，在有温度波动的实际废水中更具有应用价值，且嗜低温好氧反硝化菌的发现也为好氧反硝化菌在低温地区的应用打下了基础.

4.2溶解氧（DO）

溶解氧的浓度不仅决定了好氧反硝化菌的有无，而且还影响了其丰度和生理活性.前文提到反硝化过程涉及4种酶，这4种酶的合成和活性均受到溶解氧的影响，其中对氧的耐受程度最高的是硝酸盐还原酶有实验表明，当溶解氧浓度低于0.2 mg/L时一氧化二氮还原酶受到抑制，而硝酸盐还原酶在溶解氧浓度高于4mg/L时受到抑制，可以看出溶解氧浓度会对反硝化过程的路径及其产物造成影响.

好氧反硝化菌种类繁多，不同的好氧反硝化菌对溶解氧的耐受程度不同，如表2所示，大多数好氧反硝化菌的最佳溶解氧浓度在2-7 mg/L之间，一些好氧反硝化菌在6-7 mg/L时仍表现出很强的反硝化能力，展现出对氧很强的耐受性，这也更体现了好氧反硝化的优势.Huang等发现对好氧反硝化菌柠檬酸杆菌属Citrobacter diversu sp.而言，该菌属的细胞生长速率和反硝化速率随着溶解氧浓度的升高呈现先上升后下降的趋势，在溶解氧浓度为5 mg/L时反硝化速率最高.总之，DO浓度对好氧反硝化过程是一个非常重要的影响因素，在一定范围内DO浓度的增加会促进好氧反硝化过程.

4.3碳源种类及碳氮比

碳源给细菌的生命活动提供能量的同时也给好氧反硝化过程提供了电子供体，所以它同时影响了好氧反硝化菌的生长和脱氮效率.好氧反硝化菌可利用的主要碳源有葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠和柠檬酸钠等，少数也能利用某些难降解有机物.好氧反硝化菌的碳源利用多样性有利于其在微生物系统中取得竞争优势，有利于好氧反硝化菌在實际废水处理中的应用.从表2可以看出，不同的好氧反硝化菌有着不同的最佳利用碳源，但是大多数利用乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠这一类小分子碳源时都有着更好的脱氮效率.Chen等对好氧反硝化菌Agrobacterium sp.LAD9进行了碳源的影响因素实验，发现和葡萄糖、蔗糖这类大分子碳源相比，丁二酸钠和柠檬酸钠为碳源时好氧反硝化菌生长速率更快.由此可以推测可能是小分子碳源的结构简单，更容易被好氧反硝化菌利用，从而有利于好氧反硝化菌的生长和生命活动.除了少数特例之外，大多数好氧反硝化菌被证明更适应小分子碳源.

大多数好氧反硝化菌都是异养菌，通常需要外加碳源提供电子，若碳源不足则会导致电子供体不足，所以碳氮比对好氧反硝化过程影响明显.如表2所示，好氧反硝化菌可利用的碳氮比范围较广，好氧反硝化菌的宽广碳氮比适应范围有利于其在实际工程中的应用.有研究表明，对好氧反硝化菌Pseudonocardia ammonioxydans H9T而言，碳氮比在2～12范围内，反硝化效果和碳氮比成正比.可以看出，对于好氧反硝化菌而言，低碳氮比会导致碳源不足，电子供体不足，反硝化过程不彻底，所以在一定范围内随着碳氮比增高反硝化效果增强，而在高碳氮比条件下，碳氮比成了非限制因素，对反硝化效果影响不明显.

4.4pH值

pH值是影响反硝化过程的一个重要因素，对于好氧反硝化过程亦是如此.Guo等发现好氧反硝化菌P.Stutzeri strain T1在中性和碱性环境中有利于好氧反硝化过程.在微生物的反硝化过程中，细胞会产生碱性物质使环境中pH值升高，而pH值升高又可以加速氨氮的氧化去除，所以维持微生物环境中合适的pH值是非常重要的.

5好氧反硝化菌在污水处理和环境修复中的应用

针对传统厌氧反硝化的缺点，越来越多的研究者们专注于新型脱氮技术的研究.好氧反硝化作为新型脱氮技术的一种重要处理方法，和传统反硝化相比拥有很多优势：脱氮过程中好氧反硝化菌的加入使同步硝化反硝化（sND）变为了现实，极大地节省了反应器的占地面积，降低了设施的建设成本和运营成本;好氧反硝化菌多为异养硝化好氧反硝化菌，相比于传统脱氮过程中的自养硝化细菌，生长繁殖更迅速，反应器启动更快，且对外界环境的适应性更强.所以，好氧反硝化具备很高的应用价值和前景，具有广阔的应用空间.

5.1污水生物处理

5.1.1生物膜法

李佳等利用接种了好氧反硝化菌LJl2的人工快速渗滤系统（cRfI）处理含氮废水，按照淹水期和落干期比例1：3间歇式布水，水力负荷1.0m/d持续进水，经过7d的适应期之后，化学需氧量（cOD）去除率83%，NH+4-N去除率92%，总氮（TN）去除率71%，达到了较好的脱氮效果.邓康等利用好氧反硝化菌强化的曝气生物滤池（BAF）工艺处理含氮废水，在碳氮比为67、DO浓度为3.5mg/L的条件下，挂膜成功后氮去除率大于90%且几乎没有亚硝酸盐的累积.夏四清等用悬浮载体生物膜反应器（sCBR）处理含氮废水时实现了同步硝化反硝化（sND），在最佳碳氮比条件下，装置运行稳定后COD去除率能够达到90%以上，脱氮效率超过83.3%.生物膜法具有让好氧反硝化菌更容易挂膜和固定化的优势，因此在好氧反硝化菌的污水生物处理应用中占了主导地位，且在诸多实验室小试中，好氧反硝化菌在生物膜装置中的脱氮效果都达到了良好的预期，目前实验研究中也出现了越来越多的适合好氧反硝化的生物膜装置.生物膜法虽然在实验室小试中取得了良好的效果，不过由于成本高、调料堵塞问题以及耐冲击负荷不强等因素，也给好氧反硝化菌的应用带来了一定困难.

5.1.2活性污泥法

Pai在稻田沉积物中分离得到一株好氧反硝化菌种，并将其接种到活性污泥中强化污水脱氮，实验室条件下TN去除率可以达到50%[491.Bouchez将分离得到的好氧反硝化菌Microvirgula aerodenitrificans采用海藻酸钠包埋技术固定化并结合连续流反应器（TR）处理城镇污水，控制DO浓度在5.3mg/L;流量在5L/d的条件下，该菌可以在反应器中大量繁殖，且在7-37d内氮去除率26.8%.刘雪洁用接种了好氧反硝化菌（假单胞菌属施氏假单胞菌）的膜生物反应器（sBR）处理含氮废水，控制条件在c/N为10，DO浓度小于2 mg/L，水力停留时间（HRT）为24h下，运行稳定后COD去除率可以达到100%，TN去除率稳定分布在30%～40%之间，平均36.83%.Yang等将分离得到的好氧反硝化菌Acinetobacter junii YB接种到SBR池中处理高氮废水，采用HRT为24 h、污泥保留时间20 d、每12 h循环的控制条件，并与空白对照组对比，发现接种了好氧反硝化菌的实验组的NH+4-N去除率相比空白组从93.75%提高到99.71%，TN去除率则从75.89%提高到94.29%.可以看出，好氧反硝化菌应用于活性污泥法处理污水取得了一定效果，不过由于固定化等不足，在实验室小试中，活性污泥法总的来看比生物膜法在脱氮效果方面略显不足.由于活性污泥法在大型污水处理方面的优势，好氧反硝化菌在活性污泥法方面的应用有着更广阔的前景，需要更进一步研究.

5.2河湖原位修复

好氧反硝化不仅仅可以运用于污水生物处理，同样可以适用于河湖原位修复.丁炜等用河道型固定化生物膜反应装置原位修复微污染水体，投加好氧反硝化菌Pseudomonassp.菌剂后，硝氮积累明显减少，TN去除率提升10%左右.针对贫营养微污染水源地水质脱氮，黄廷林等发明了扬水曝气一生物膜组合系统，其中投加好氧反硝化菌群制成的菌剂，装置运行期间硝氮、总氮、高锰酸盐指标（cODMn）及总有机碳（TOC）去除率分别达到72.3%、71.3%、32.3%及34.8%，稳定期水质满足地表水环境Ⅲ类水标准要求.相比于污水处理，河湖原位修复的环境条件更多样，不可控性也增加，不同的环境条件需要与之相适应的不同的好氧反硝化菌，同时在自然环境中，对好氧反硝化菌的竞争性和处理效果的稳定性要求更高.

6存在问题与展望

目前的研究表明，好氧反硝化菌在自然界中广泛存在，研究人员也分离出了多株高效脱氮的好氧反硝化菌，对水质条件及水质变化耐受性强，可利用碳源多，可以实现同步硝化反硝化，在工程应用方面极具价值和前景.随着对好氧反硝化菌的研究深入，好氧反硝化菌在生物脱氮方面表现出良好的优势和潜力，但在脱氮效果稳定性、菌的固定化及温室气体排放等方面仍有待进一步研究.

（1）目前对好氧反硝化菌剂的研究主要在液体菌剂阶段，液体菌剂不利于长期保存，而固体菌剂例如粉末和胶囊在工程中更方便使用，這可以作为好氧反硝化菌剂研究的一个重点方向.

（2）好氧反硝化的实现使得同步硝化反硝化成为现实，但两者的作用机理关系并不相同，仍有待探究.

（3）在研究好氧反硝化菌适用的碳源方面，尝试筛选出更廉价易得的碳源来替代实验室常用碳源，提高好氧反硝化菌在这些碳源下的脱氮效率，降低应用成本.

（4）好氧反硝化装置效果稳定性问题及菌的固定化问题有待进一步研究.

（5）目前的研究集中在模拟废水的小试，与实际废水和小规模工程应用仍有较大差距.