水稻OsVDAC4诱饵蛋白载体的构建及鉴定

白雪琪等

摘要  {目的]获得可用于筛选膜蛋白酵母双杂交文库的诱饵蛋白载体。{方法]在对OsVDAC4进行生物信息学分析的基础上，将OsVDAC4全长ORF分别与pBT3-N和pBT3-SUC连接，构建2个诱饵蛋白载体pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub，利用膜蛋白酵母双杂交技术鉴定出可用于篩库的诱饵蛋白载体。{结果]pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub都可以与目标蛋白互作，但由于OsVDAC4的N端有约50个可自由伸展的氨基酸残基导致pBT3-OsVDAC4-N-Cub本底反应非常强，OsVDAC4的C端存在于膜中而没有可自由伸展的氨基酸残基，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的本底反应很弱。{结论]pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub可用于文库筛选，这为获取OsVDAC4的互作蛋白提供了基础。

关键词   OsVDAC4;诱饵蛋白载体;膜蛋白酵母双杂交

中图分类号S  188文献标识码A文章编号0517-6611（2018）36-0090-05

电压依赖性阴离子通道（voltagedepeendentanionchannels，VDACs）最早是从草履虫线粒体外膜上分离得到的{1]，它广泛存在于线粒体外膜上，是线粒体外膜上最丰富的蛋白之一{2]。VDACs通过与胞质、线粒体和细胞骨架蛋白以及其他膜通道相互作用，通过线粒体外膜的代谢物或离子转运以及线粒体介导的细胞凋亡和能量代谢等参与许多细胞进程{3-4]。VDACs可以折叠成19-β-链的桶状结构，且它的N末端在桶外部并且包含α-螺旋结构{5]。几乎所有细胞功能都依赖复杂的蛋白间相互作用来完成{6]。为了探究水稻中VDAC的结构、功能及作用机理，生物技术国家民委重点实验室植物遗传与发育课题组之前在日本晴中鉴定出8种VDAC蛋白，并对其结构及表达模式等进行了预测，OsVDAC4编码317个氨基酸{7]，OsVDAC4蛋白定位于线粒体{8]。为了研究OsVDAC4的作用机理，必须获取与其相互作用的蛋白质因子。用于膜系统相互作用蛋白筛选的膜酵母双杂交系统要求相互作用的蛋白均位于细胞质中，所以该研究针对预测得到的OsVDAC4跨膜方式，构建2种不同的OsVDAC4全长的诱饵蛋白载体（pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub），鉴定出适合筛选OsVDAC4互作蛋白的诱饵载体，为筛选OsVDAC4的互作蛋白奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

酵母菌株NMY51、载体pBT3-N、pBT3-SUC、pPR3-N均购自DualsystemsBiotech公司;限制性内切酶SfiI、T4DNA连接酶购自BioLabs公司;各种氨基酸、YNB、X-Gal、Zbuffer均购自Coolaber公司;3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）、RNaseA、鲑鱼精购自SIGMA公司;琼脂、DMSO购自赛国生物科技有限责任公司;酵母提取物、PEG4000购自OXOID公司;氯化钠、醋酸锂、葡萄糖、鱼粉蛋白胨购自国药集团化学试剂有限公司;片段回收试剂盒购自Axygen公司;酵母质粒提取试剂盒购自康为公司;ExTaq酶、反转录试剂盒购自TaKaRa公司;水稻粤泰B幼穗cDNA文库、日本晴种子由中南民族大学生物技术国家民委重点实验室提供。

1.2仪器

C1000touchthermalcyclerPCR仪（美国Bio-Rad）;UniversalHoodⅡ凝胶成像系统（美国）;HeraeusMultifugeX1R高性能通用台式冷冻离心机（德国）;HeraeusPico21Centrifuge微量台式冷冻离心机（德国）;SBD50-1水浴锅（丹麦Heto-Holten）;NanodropND-2000超微量核酸蛋白测定仪（美国）;DH4000A电热恒温培养箱（中国）;SW-CJ-2FD双人单面净化工作台（中国）;72N紫外可见分光光度计（中国）;ZQZY-70BS两层小容量振荡培养箱。

1.3方法

1.3.1

RNA的提取与反转。取日本晴1～2cm的幼穗放入预处理后预冷的研钵中，加入液氮快速研磨，将100mg粉末转移到RNasefree的1.5mLEP管中，加入1mLTRIzol，迅速混匀。室温静置5min后加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min。4℃12000r/min离心15min，吸取400μL上清。加入500μL异丙醇，混匀，室温静置10min。4℃12000r/min离心15min，得到白色沉淀。沉淀用1mL75%乙醇（DEPC水配制）洗涤2次，晾干后加20μLDEPC水溶解。65℃水浴5min，测定RNA浓度，取2μLRNA样品进行电泳检测，剩下样品用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser试剂盒进行反转录，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.3.2

OsVDAC4的扩增。从日本晴幼穗cDNA中分别扩增出用于连接pBT3-N和pBT3-SUC的目的片段OsVDAC4-N和OsVDAC4-SUC。20μLPCR反应体系组成为10×Buffer2μL、2.5mmol/LdNTPsmixture1μL、10μmol/LOsVDAC4ORF扩增引物（表1）各0.3μL、5U/μLExTaq0.1μL、cDNA模板1μL，无菌水15.3μL。PCR反应程序为95℃预变性5min;95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环;72℃延伸10min。反应结束后，取2μL产物进行电泳检测，剩下产物用于切胶回收。用Axygen公司的切胶回收试剂盒回收目的片段，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.3.3诱饵蛋白载体构建。用限制性内切酶SfiI分别酶切PCR扩增后回收的OsVDAC4-N、OsVDAC4-SUC以及载体pBT3-N和pBT3-SUC质粒。50μL酶切反应体系组成为DNA15μL、10×NEBbuffer5μL、20U/μLSfiI1μL、无菌水29μL，50℃酶切6h。用Axygen公司的清洁回收试剂盒回收酶切后的DNA，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.3.3.1

目的片段与载体的连接。将回收的目的片段OsVDAC4-N连接载体pBT3-N，OsVDAC4-SUC连接载体pBT3-SUC。20μL连接体系组成为质粒1μL、目的片段5μL、10×T4-Ligasebuffer2μL、2.5U/μLT4-Ligase1μL、无菌水11μL，16℃过夜。

1.3.3.2连接产物转化大肠杆菌。从-80℃冰箱中取出制备好的感受态细胞，置于冰浴上解冻，加入连接产物，混匀，在冰浴上静置30min，42℃热激90s，冰上放置5min，再加入800μLLB液体培养基（不含抗生素），37℃180r/min1h。取100μL菌液涂抗性平板，37℃倒置培养过夜。

1.3.3.3

重组质粒的阳性鉴定。从平板上挑取单菌落于液体培养基中37℃培养过夜（180r/min），取菌液1.4mL收集菌体，加100μLSolutionⅠ使沉淀重悬，加200μLSolutionⅡ，混匀后放置冰浴3min，加150μLSolutionⅢ，混勻后冰浴放置5min。4℃14000r/min离心5min，取上清至另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，摇匀，4℃14000r/min离心10min，沉淀用500μL75%乙醇洗涤2次。晾干后加入30μL1×TE（1∶1000加入RNaseA），溶解后4℃保存。

分别用pBT3-NF/pBT3-NR，pBT3-SUCF/pBT3-SUCR引物（表1）进行重组质粒的阳性鉴定，PCR体系和程序同“1.3.2”。

1.3.4诱饵蛋白载体的筛选。

1.3.4.1

酵母菌株NMY51的活化与收集。取保存的酵母菌株NMY51在1×YPAD平板上划线后30℃培养3d。挑取单菌落于50mL1×YPAD液体培养基中30℃过夜培养（200r/min）。当酵母OD546达0.6～0.8时，将菌液置于冰上至完全冷却。将菌液转移至50mL离心管中，2500r/min离心5min收集菌体，再用2.5mL无菌水重悬菌体，置于冰上，备用。

1.3.4.2

PEG/LiOAcMasterMix的制备。将鲑鱼精DNA（10mg/mL）稀释至2mg/mL，沸水煮10min，立即置于冰上备用。配制PEG/LiOAcMasterMix5份，每份组成为50%PEG4000240μL、1mol/LLiOAc36μL、2mg/mL鲑鱼精DNA25μL，总体积301μL。

1.3.5抑制假阳性3-AT浓度的筛选。将质粒pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub和pBT3-OsVDAC4-N-Cub分别转化入酵母菌NMY51，获得含诱饵蛋白载体的酵母菌株。再将文库空载质粒pPR3-N分别转化入含不同诱饵蛋白载体的酵母菌株，用2×YPAD液体培养基30℃培养90min（150r/min）。收集菌体并用0.9%NaCl溶液重悬菌体，取300μL菌液涂布含有不同浓度3-AT的SD-Trp-Leu-His-Ade平板，30℃倒置培养3～4d。

1.3.6酵母阳性克隆LacZ活性检测。参考谌鑫{9]的方法，按20μLX-gal（20mg/mL）∶12μLβ-巯基乙醇∶2mLZbuffer配制染色液，加到放置有2张滤纸的9cm培养皿中，使滤纸浸湿。取一张浸湿的滤纸，覆盖在已30℃培养3～4d的菌体表面，轻按滤纸后用镊子小心揭下，并置于液氮中迅速冷冻10～30s，然后在室温中解冻。将解冻的滤纸置于另一张浸湿的滤纸上，注意让粘有菌体的一面朝上，赶走滤纸间的气泡。30℃孵育5min，观察菌斑是否显出蓝色。

2结果与分析

2.1OsVDAC4的跨膜结构及空间结构预测

用PRED-TMBB{10]和BOCTOPUS{11]在线软件对OsVDAC4的跨膜结构进行预测，结果发现OsVDAC4有14次跨膜，其C端跨膜结构较为集中，且C端可能位于膜内靠内侧、N端位于膜内侧（图1）。进一步用I-TASSER预测OsVDAC4的空间结构{12]，根据https：∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/预测（图2），OsVDAC4的C端可能位于膜内靠内侧，与PRED-TMBB和BOCTOPUS的预测一致;而N端预测结果稍有差异，有可能位于膜内侧，也有可能位于膜外侧，还有可

2.2诱饵蛋白载体构建

试验表明，OVDAC4在花药中有高表达，而在其他部位几乎都不表达{7]，所以用日本晴幼穗提取RNA，反转成cDNA，用于扩增OsVDAC4。OsVDAC4全长954bp，从图3可以看出PCR扩增出来的条带大小正确，可以用于下一步试验。

将片段用试剂盒回收后，连接载体pBT3-N和pBT3-SUC。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，涂带有Kan的抗性平板，挑取单菌落扩大培养，提取质粒。图4是对质粒进行PCR后的结果，条带大小正确，测序结果表明序列正确，可用于诱饵蛋白载体的筛选。

2.3OsVDAC4诱饵蛋白载体的筛选

泛素蛋白可以分为Cub（包含泛素蛋白的第34～76氨基酸）和NubI（包含泛素蛋白的第1～38氨基酸），Cub与NubI在自然条件下可以形成完整的泛素蛋白，而将NubI突变成NubG之后，Cub与NubG在自然条件下不能形成完整的泛素蛋白。AIg5蛋白是一种广泛存在于酵母中的跨膜蛋白，其N端和C端均位于细胞质中。该试验采用3种不同载体的AIg5蛋白（pAI-AIg5-N-NubI、pDL2-AIg5-N-NubG和pCCW-AIg5-C-Cub），pAI-AIg5-N-NubI与pCCW-AIg5-C-Cub作为阳性对照{9]。为了确定诱饵蛋白OsVDAC4的哪一端存在于细胞质中可以与互作蛋白作用，分别将其N端与带有Cub的载体pBT3-N相连（pBT3-OsVDAC4-N-Cub），C端与带有Cub的pBT3-SUC

相连（pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub），当诱饵蛋白载体连有泛素Cub的N端或C端也位于细胞质时，便能同AIg5的N

端或C端连接上的NubI相互结合，形成完整泛素分子，最终导致报告基因的表达，酵母可以在四缺培养基SD-Trp-Leu-His-Ade（SD-4）上生长，GUS染色为蓝色。该试验将5组质粒DNA分别共转入酵母细胞，阳性对照组（pAI-AIg5-N-NubI+pCCW-AIg5-C-Cub）在SD-Trp-Leu（SD-2）平板上长出白色菌落，在四缺培养基SD-Trp-Leu-His-Ade平板上稀释了10-4后也长出菌落（图5A），说明阳性对照组间的互作明显高于试验组和阴性对照组。试验组pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-OsVDAC4-N-Cub（第2组）和pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub（第3组）在SD-Trp-Leu培养基上都有生长，在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上也有生长，但第3组在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上的长势优于第2组。在SD-Trp-Leu平板上第2组长出的菌落是白色的，而第3组长出的菌落是粉红色的，根据DUALmembranestarterkitsUserManual上的说明，当2个蛋白之间相互作用弱时，

酵母体内的腺嘌呤合成途径受阻，会有红色代谢物积累，因

此酵母会呈现出粉红色，而第3组在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上呈现出白色菌落，且生长状态良好，SD-Trp-Leu培养

基中要比SD-Trp-Leu-His-Ade培养基中多加了Ade和His这2种氨基酸，由此推测在SD-Trp-Leu培养基上酵母呈现出粉红色可能是由于培养基中的Ade足够酵母生长所需，不需要自身合成，于是酵母呈现粉红色。但阴性对照组pBT3-OsVDAC4-N-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第4组）和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第5组）在SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade平板上均有生长，第5组的长势较弱（图5A）。进一步检测LacZ的活性，发现阴性对照组也能染为蓝色（图5B）。这些结果说明pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub都可以用于筛选膜酵母双杂交文库，但可能具有较高的本底反应。

为了降低本底反应，进行3-AT的严谨性优化。将文库空载pPR3-N分别转化至含有诱饵蛋白载体pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的酵母菌株中。pPR3-N上带有突变的NubG，诱饵蛋白载体pBT3-SUC-OsVDAC4上带有Cub，为了减少假阳性，消除本底反应，在用3-AT来减少假阳性的同时也使蛋白互作相对较弱的菌能够生长，设置了4个浓度梯度，分别是0、1.0、2.5、5.0mmol/L，重复3次试验，结果表明在不加3-AT的条件下文库空载pPR3-N与诱饵蛋白载体pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub没有发生本底反应（图6），而文库空载pPR3-N与诱饵蛋白载体pBT3-OsVDAC4-N-Cub在试验所用的3-AT浓度范围内本底反应很强，随后加大3-AT浓度，到80mmol/L还是有很强的本底反应。这些结果说明诱饵蛋白载体pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub可以用于膜酵母双杂交文库的筛选。

3讨论

生物技术国家民委重点实验室植物遗传与发育课题组之前在日本晴中鉴定出了8个VDAC基因，即OsVDAC1～8。利用生物信息学方法对OsVDAC1～8进行了结构分析，并通过RT-PCR技术分析了OsVDAC1～8的表达模式，尝试构建部分OsVDACs的RNAi植株，并取得初步成功。然后对OsVDACs的原核、真核表达进行研究，并对OsVDACs进行亚细胞定位。通过膜蛋白酵母双杂交技术从YTB幼穗cDNA文库中筛选到了OsVDAC3的3个互作蛋白，成功得到了OsVDAC3超表达植株，并进一步验证了OsVDAC3与其互作蛋白间的互作。成功得到了OsVDAC5的RNAi转基因植株，并筛选得到了7个与OsVDAC5（1～75aa）互作的蛋白{9]，将其命名为OsV5IP1～7，为了探索OsVDAC5（1～75aa）与OsV5IP1～7是否真正互作，还进行了酵母双杂、pulldown、BiFC、亚细胞定位，试验结果显示它们之间发生了互作。

该试验从日本晴幼穗cDNA中扩增出OsVDAC4全长片段，连接载体pBT3-N和pBT3-SUC，得到重组载体pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub。在正式筛选文库之前对2个诱饵蛋白载体进行筛选，结果表明pBT3-OsVDAC4-N-Cub的试验组和阴性对照都长势良好，相比较而言，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的试验组长势良好的同时，阴性对照长势较弱。并且在之后的3-AT浓度筛选试验中发现，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub与文库空载几乎没有发生本底反应，而pBT3-OsVDAC4-N-Cub與文库空载发生的本底反应难以抑制，所以pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub载体更合适筛库。根据生物信息学分析，上述试验结果产生的原因可能是由于OsVDAC4的C端位于膜结构中，与之相连的Cub自由度较小，难以与没有互作的空间上较远的NubG反应，因此本底反应弱。OsVDAC4的N端Cub与没有互作的空载上的NubG具有很强的互作，说明其N端没有在膜内侧或膜中间的桶状结构中，而是位于膜外侧的细胞质中;由于其N端有约50个氨基酸残基在膜结构外面处于伸展状态，因此与它相连的Cub可以与在空间上相距很远的NubG互作，表现为很强的本底反应。综上所述，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub更适合于下一步进行互作蛋白的筛选。

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