HPLC法测定保健食品中叶黄素含量

周立梅 杨磊 张金秋

摘要 [目的]建立改良的HPLC-C18法测定保健食品中叶黄素含量。[方法]优化样品前处理方法，通过单因素考察对破囊溶剂种类、破囊时间、提取时间、提取溶剂进行优化，采用常规HPLC-C18分析方法进行测定。色谱条件为：流动相甲醇，流速1.0 mL/min，检测波长446 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。[结果]叶黄素在0.139 6～2.094 0 μg/mL与峰面积线性关系良好，平均回收率为99.55%， RSD为2.21%。[结论]改良后的方法操作简便、准确、稳定，所用试剂绿色环保，可用于保健食品中叶黄素含量测定。

关键词 高效液相色谱；保健食品；叶黄素；含量测定

中图分类号 TS207.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）20-0164-03

Abstract [Objective]The research aimed to establish an improved HPLCC18 method for the determination of lutein in health foods.[Method]Optimization of sample pretreatment method，using single factor to optimize in four aspects，the type of solvent to splitting microcapsules，time of splitting microcapsules，time of extraction and solvent extraction.The extractive was analyzed by conventional HPLCC18.HPLC conditions：mobile phase was methanol，mobile phase rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was 446 nm，oven temperature was 30 ℃，injection volume was 20 μL.[Result]Lutein had good linear relationship within the range of 0.139 6-2.094 0 μg/mL，the average recovery was 99.55%，the RSD was 2.21%.[Conclusion]The improved method is easy to operate，accurate and stable，the solvent is environment friendly for quantitative analysis of lutein from the health food.

Key words HPLC；Health food；Lutein；Determination of content

叶黄素属于含氧类胡萝卜素，主要存在于深绿色蔬菜（菠菜、羽衣甘蓝等）、蛋黄、玉米、柑橘类等水果中，人体不能直接合成。越来越多流行病学和临床试验表明，膳食或血清中较高含量的叶黄素可降低眼部疾病患病风险[1]。作为生理活性物质，叶黄素在医学和功能食品领域具有广阔的研究开发前景[2]。

目前，利用HPLC法测定保健食品中叶黄素含量的方法有2种，一种是以C30为分离色谱柱的测定方法[3]，另一种是党亚敏等[4]以C18为分离色谱柱的测定方法，其中C30分离色谱柱使用不广泛。测定叶黄素的色谱条件相对成熟，但是样品处理方法很多，如无水乙醇超声提取法[4]、石油醚超声提取法[5]、水提正己烷—乙酸乙酯萃取法[6]等。为保证样品中叶黄素被充分提取，该研究在优化破囊溶剂、提取溶剂和提取时间的基础上，采用HPLC-C18法测定保健食品中葉黄素含量。

1 材料与方法

1.1 试材

叶黄素原料，荷兰帝斯曼集团；样品来源于吉林省现代中药工程研究中心有限公司；叶黄素对照品，Sigma公司；甲醇，色谱纯，Fisher Scientific；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器 UitiMate3000液相色谱仪，ACE C18色谱柱，美国ACE公司；ULtra-6100紫外可见分光光度计，北京普源精电科技有限公司；AB135-S电子天平，梅特勒-托利多集团公司；SB-1200D型数控超声波清洗机，宁波新芝生物股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件。ACE C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱，流动相为甲醇，流速为1.0 mL/min，叶黄素检测波长为446 nm，柱温30 ℃，进样量为20 μL。

1.3.2 对照品溶液的制备。

1.3.2.1 标准储备液。准确称取5 mg（精确至0.01 mg）叶黄素标准品，以0.1%BHT（二丁基羟基甲苯）乙醇溶液溶解并定容至100 mL。该标准储备液充氮避光置于-20 ℃或以下的冰箱中可保存6个月。

1.3.3 样品溶液的制备。精密称取样品0.1 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入60 ℃水5 mL，超声处理3 min，取出，放冷，加入0.1% BHT乙醇溶液至接近刻度，未定容，继续超声处理10 min，取出，放冷，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，摇匀。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液稀释并定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，供液相测定[7]。

1.3.4 单因素试验。

1.3.4.1 破囊溶剂的选择。在检测微胶囊型叶黄素的过程中，至关重要的一点是对待检样品进行前处理，根据文献和相关资料[4，7-8]，对N，N—二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、60 ℃水3种破囊溶剂进行考察。精密称取样品0.1 g，置25 mL棕色容量瓶中，加入60 ℃水5 mL，超声处理5 min，取出，放冷，加入无水乙醇至刻度，摇匀。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，供液相测定。

1.3.4.2 破囊时间的选择。因本品所用原料为叶黄素微囊，破囊时间的确定对含量测定十分必要，该研究分别考察了破囊时间为3、5、7 min时原料和样品的含量。

1.3.4.3 提取时间的选择。为保证样品中叶黄素溶出后被充分提取，需对叶黄素的提取时间进行了考察。分别考察了提取时间为5、10、15 min时原料和样品的含量。

1.3.4.4 提取溶剂的选择。在参考文献[8]的基础上，分别对提取溶剂0.1%BHT无水乙醇溶液和无水乙醇进行考察，在0、2、4、8、12、18、24 h进样测定，测定叶黄素含量。

1.3.5 方法学考察。

1.3.5.1 标准曲线和线性范围。从叶黄素标准储备液中准确移取0.05、0.10、0.20、0.40、1.00 mL溶液至5个25 mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，得到浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、2.0 μg/mL的系列标准工作液。标准工作液充氮避光置于-20 ℃或以下的冰箱中可保存1个月。在“1.3.1”色谱条件下，以对照品溶液浓度为横坐标、测得的峰面积为纵坐标， 绘制标准曲线。

1.3.5.2 精密度试验。精密吸取“1.3.4.1”项下方法制备的含叶黄素0.4 μg/mL的对照品溶液20 μL，按“1.3.1”色谱条件连续进样6次，记录峰面积。

1.3.5.3 重复性试验。精密称取样品6份，按“1.3.3”项下方法平行制备样品溶液，在“1.3.1”色谱条件下进样，测定样品中叶黄素的含量。

1.3.5.4 稳定性试验。精密吸取同一样品溶液，于制备后的0、2、4、8、12、24 h，在“1.3.1”色谱条件下进样，记录峰面积。

1.3.5.5 加样回收率试验。分别精密称取6份已知含量的样品0.050 0 g，置25 mL棕色容量瓶中，再分别精密加入叶黄素对照品溶液（浓度为0.716 7 mg/mL）2.0 mL，加入60 ℃水5 mL，超声处理3 min，取出，放冷，加入0.1%BHT乙醇溶液至接近刻度，未定容，继续超声处理10 min，取出，放冷，用0.1%BHT乙醇溶液定容至刻度，摇匀。精密吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液稀释并定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，在“1.3.1”色谱条件下进样，测定样品中叶黄素的含量，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 破囊溶剂的选择。从表1可看出，二甲基亚砜和60 ℃水转移率合理，破囊效果无明显差异，考虑到二甲基亚砜刺激眼睛、呼吸系统和皮肤，水无毒、绿色环保，故选择60 ℃水作为破囊溶剂。

2.1.2 破囊时间的选择。从表2可看出，破囊时间为3和5 min 时，原料和样品含量无明显差异；破囊时间为7 min时，原料和样品含量有所下降。从操作简单、耗时短方面考察，确定破囊时间为3 min。

2.1.3 提取时间的选择。

从表3可看出，超声时间过长会造成原料和样品含量降低，超声时间为10 min时，原料和样品含量较合理。

2.1.4 提取溶剂的选择。无水乙醇稳定性试验结果（表4）显示，叶黄素含量的RSD为4.60%，表明无水乙醇样品溶液在24 h内不稳定。0.1%BHT乙醇溶液稳定性试验结果（表4）显示，叶黄素含量的RSD为1.86%，表明0.1%BHT乙醇溶液样品在24 h内稳定。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察。

以对照品溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出线性方程为：Y=5.110 9X-0.063 6（R2=0.999 9）。表明叶黄素在0.139 6～2.094 0 μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.2.2 精密度试验。从表5可看出，叶黄素峰面积的相对标准偏差RSD为1.76%，表明仪器精密度高。

2.2.3 重复性试验。从表5可看出，叶黄素含量的RSD为1.54%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验。从表6可看出，叶黄素的平均回收率为99.55%，RSD为2.21%，表明叶黄素的加样回收率良好。

3 结论与讨论

该研究测定叶黄素是在党亚敏等[4]研究的基础上进行了优化，分别考察了N，N—二甲基甲酰胺[4]、60 ℃水[7]、二甲基亚砜[8]3种破囊溶剂，确定了破囊溶剂为60 ℃水，与其他2种破囊溶剂比较，转移率最为合理且无毒、绿色环保；对样品提取溶剂进行了优化，在无水乙醇的基础上增加了0.1%BHT[8]，样品溶液中叶黄素在24 h很稳定，解决了叶黄素在测定过程中不稳定的缺点；对破囊时间、提取时间进行优化和方法学考察，确定破囊时间为3 min，提取时间为10 min，此条件下叶黄素可被充分提取。综上所述，该方法操作简便、适用性强、重现性好、稳定性佳，所用试剂绿色环保，此方法可用于保健食品中叶黄素含量测定。

参考文献

[1] 李大婧，庞慧丽，刘春泉.叶黄素和玉米黄质对眼睛的保护作用研究进展[J].江苏农业科学，2013，41（9）：1-4.

[2] 李大婧，刘春泉，白云峰，等.叶黄素、玉米黄质研究进展：叶黄素、玉米黄质的结构、性质和生物学功能[J].核农学报，2006，20（1）：64-67.

[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品中叶黄素的测定：GB 5009.248—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4] 党亚敏，李建平，张明月，等.高效液相色谱法测定保健食品中的叶黄素[J].中国卫生检验杂志，2011，21（7）：1650-1651.

[5] 黄声岚，俞晓玲，柯加法，等.高效液相色谱法测定食品中的叶黄素[J].海峡预防医学杂志，2009，15（4）：48-50.

[6] 张莉华，许新德，陈少军，等.HPLC法测定食品中的叶黄素含量[J].粮油食品科技，2007，15（1）：60-62.

[7] 白鸿.保健食品功效成分检测方法[M].北京：中国中医药出版社，2011：258-261.

[8] 鲁杰，方从荣，高洁，等.微胶囊化功能性番茄红素产品的高效液相色譜测定法改进[J].中国食品添加剂，2013（3）：99-102.