酿造酱油中10种单体酚酸成分的检测分析

张露　梁寒峭　刘伟

摘要[目的]建立一种可以同时检测10种酚酸含量的高效液相分析方法。[方法]以无添加特级酿造酱油和普通特级酿造酱油、三级酱油为研究对象，分析总多酚和单体酚酸种类与含量。[结果]该方法操作简便，准确度和重复性好。3个样品的酚酸种类相似，无添加特级酱油的总酚酸含量为251.870 mg/L，显著高于普通特级酱油（109.655 mg/L）和三级酱油（42.461 mg/L），其中儿茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸4种单体酚酸含量显著高于普通特级酱油和三级酱油。[结论]酚酸类成分的组成和含量分析可为酿造酱油品质研究提供更全面的评价思路。

关键词酿造酱油；总酚酸；单体酚酸；高效液相

中图分类号TS207.3文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）25-0172-04

Detection and Analysis of Ten Monomeric Phenolic Acids in Fermented Soy Sauce

ZHANG Lu1，LIANG Hanqiao1，2，LIU Wei3 et al

（1.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015；2.Dean of Biomedical School，Beijing City University，Beijing 100094；3.Liaocheng Zhengxin Ecological Agricultural Science and Technology Parks Co.，Ltd，Liaocheng，Shandong 252000）

Abstract[Objective] The research aimed to establish an analysis method of 10 kinds of phenolic acids by HPLC.[Method]Taking no added special grade soy sauce，ordinary special grade soy sauce and No.3 soy sauce as research object，the type and content of total polyphenols and monomeric phenolic acids were analyzed.[Result]The methods were convenient with high recovery rate，good repeatability and accuracy.There was no difference of the total polyphenol contents and phenolic acids species among three samples.However，total phenolic acids content of no added special grade soy sauce was 251.870 mg/L，which was significantly higher than that of ordinary special grade soy sauce （109.655 mg/L） and No.3 soy sauce （42.461 mg/L）.Content of catechinic acid，vanillic acid，caffeic acid and ferulic acid in no added special grade soy sauce were significantly higher than that of ordinary special grade soy sauce and No.3 soy sauce.[Conclusion]The composition and content analysis of phenolic acids can provide a more comprehensive evaluation of the quality of fermented soy sauce.

Key wordsFermented soy sauce；Total phenolic acid；Monomeric phenolic acid；High performance liquid phase

釀造酱油是以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液态调味品[1]。随着人类社会的进步和社会经济的不断发展，人们的生活水平也越来越高，调味方式的改变也逐渐成为健康饮食的要素之一，人们从片面追求色、香、味的传统调味方式转而向讲究原色、原汁、原味的现代健康调味方式[2-3]。目前在我国，无添加酿造酱油产品暂无相关标准，市场较为混乱，名称繁多，但其含义均应指原料经微生物发酵结束后，不再使用任何食品配料、食品添加剂等进行调配，制备而成的调味品。无添加酿造酱油类产品配料中只含有大豆或脱脂大豆、小麦和（或）麸皮、食盐等原料，不含有白砂糖、酵母提取物等食品配料，以及甜味剂（三氯蔗糖、安赛蜜等）、增鲜剂（谷氨酸钠、5′-肌苷酸二钠、5′-鸟苷酸二钠等）、防腐剂（苯甲酸钠、山梨酸钾等）、焦糖色素等食品添加剂[4]。因此，对于无（零）添加酱油来说，发酵过程中自然代谢产生的多酚类物质和小分子酚酸对其风味、色泽和营养均具有重要意义。

酚类物质是谷物中自然存在的一类具有比较明确的生理活性和药用价值的成分，与人体健康密切相关。酿造酱油和食醋的主要原料大豆和小麦中富含此类活性物质，在经过多区系复杂微生物的长期发酵酶解，大分子难吸收的酚类物质转化为易吸收的小分子多酚和酚酸成分[5-8]，对酿造酱油食品的风味及健康作用均具有重要的研究价值。笔者建立了一种快速、简单可同时检测10种酚酸含量的高效液相色谱分析方法，为酱油类食品的酚类研究提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试材。样品材料1由山东正信生态农业科技园有限公司提供，样品材料2和3均购自北京超市，具体信息见表1。

1.1.2试剂。

甲醇（色谱纯），美国Fisher公司；其余试剂均为分析纯；水为实验室自制超纯水（18 MΩ·cm）；酚酸标准品（对香豆酸、阿魏酸、香草酸、芥子酸、丁香酸、咖啡酸、没食子酸、对羟基苯甲酸、儿茶素、绿原酸）均购自Sigma公司，纯度95%以上。

1.1.3仪器与设备。

Thermo UltiMate 3000型高效液相色谱仪（VWD-3000紫外检测器，Chromeleon 7色谱工作站，ThermoFisher公司）；Centrifuge 5804R离心机（Eppendorf公司）；Pultton P200紫外可见分光光度计（美国宝腾公司）；十万分之一天平。

1.2方法

1.2.1样品处理。

精密吸取1.0 mL样品，加入1 mL 盐酸溶液（1∶1）混匀后，再加入5 mL乙酸乙酯振荡30次，静置取上层水层，重复3次合并水层后加入400 μL氢氧化钠水溶液（1.0 mol/L），混匀后50 ℃以下减压蒸干后，以初始流动相定容至1 mL，用滤膜过滤，取续滤液备用。

1.2.2标准溶液的配制。

分別称取没食子酸等10种酚酸标准品（10.0～20.0 mg）用甲醇溶解并转移至棕色容量瓶中，配制成0.80～1.50 mg/mL终浓度的标准贮备液封口低温保存备用，使用前根据试验需要将此标准贮备液用甲醇稀释至适宜含量使用。

1.2.3色谱条件。

Thermo Acclaim 120 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10～50 μL；流动相：A甲醇，B 1.5%乙酸水溶液；检测波长280、320 nm。洗脱程序：0～5 min，B为96%～89%；5～22 min，B为89%等度；22～23 min，B为89%～96%；23～50 min，B为96%等度；50～52 min，B为96%～74%；52～77 min，B为74%等度；77～80 min，B为74%～0%。

2结果与分析

2.1检测波长

对10种酚酸标准品溶液进行全波长扫描，结果显示，各组分均在280和320 nm处有较大吸收，其中没食子酸、咖啡酸、绿原酸和对香豆酸在280和320 nm处吸收强度差异不大，对羟基苯甲酸、儿茶素、香草酸和丁香酸280 nm处吸收更强，反之阿魏酸和芥子酸在320 nm处吸收更强。综合考虑，选取280 nm 作为检测波长为宜，在保留时间65～75 min时选用320 nm波长检测。

2.2流动相的优化由于该研究的检测目标成分酚酸均具有至少一个酚羟基或羧基，此类结构在水中易产生电离，极性增强，导致液相色谱峰拖尾严重，分离度差。因此考虑加入酸性调节剂改善拖尾现象。前期研究表明乙酸作为调节剂可显著改善酚酸类成分的拖尾[9]，提高分离度，分别考察了体积分数为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的酸浓度，结果显示酸含量越高分离度越好，考虑色谱柱寿命故选择1.5%体积浓度的乙酸水溶液和甲醇作为流动相，最终达到10种酚酸标准品和样品目标成分的基线分离（图1）。

2.3标准曲线的建立

分别配制0.08～200.00 mg/L 5个系列浓度的酚酸混合标准溶液，进样10 μL，按照“1.2.3”条件测定，以峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x）为横坐标，计算得到10条标准曲线，结果见表2。由表2可见，10种酚酸标准品溶液浓度和检测响应值呈良好的线性关系，并且检测限都较低，说明此方法灵敏度较好。

安徽农业科学2018年

2.4精密度、重复性、稳定性和加标回收试验

向已知酚酸含量的样品中定量添加混标溶液，按照“1.2.1”项条件平行制备样品6份，按照“1.2.3”条件测定含量，计算回收率；同一样品连续进样6次计算精密度；6份样品分别进样计算重复性；同一样品分别于0、20、40、60、80和100 min时间点进样计算稳定性。结果（表3）显示，各酚酸的回收率均在80%以上，精密度和重复性的RSD值均小于3%，说明此方法的准确性较高；稳定性RSD值均小于4%，说明在100 min内10种酚酸物质均较稳定。

2.5样品的检测

1号样品为无添加特级酿造酱油，2号为普通特级酿造酱油，3号为普通三级酿造酱油。从表4可看出，2款特级酱油均检测到8种酚酸，三级酱油只检测到7种酚酸成分；1号样品的总酚酸含量显著高于2号和3号样品，分别是其总含量的2.3倍和5.9倍。所有检测到的酚酸中，1号样品的儿茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸含量显著高于2号和3号样品；芥子酸显著高于2号样品，与3号样品差异不显著；1号和2号样品的对羟基苯甲酸、丁香酸和对香豆酸显著低于3号样品。酿造酱油样品中儿茶素含量最高，其次为香草酸和丁香酸，没食子酸和绿原酸均未检测到。

3讨论

酿造酱油作为我国家庭厨房使用频次最高的一种发酵类调味品，其风味和质量的高低与人民的食品安全与健康息息相关。目前国内大多数酱油产品均为“加料酱油”，谷氨酸钠（味精主要成分）、5′-肌苷酸二钠和5′-鸟苷酸二钠（鸡精主要成分）、焦糖色、苯甲酸钠等调味剂和防腐剂是常见的添加剂。我国作为酱油和醋的生产和消费大国，高端营养的酱油产品种类却寥寥无几。现今普遍认知无添加酿造酱油口感寡淡，相比“加料酱油”，具有鲜味不足、偏咸偏涩、口感不够协调、单薄留口短等缺点[3]。

酱油的口感是由游离氨基酸、有机酸、单双糖、酚酸等成分综合构成，经过前期研究发现，除添加的谷氨酸外，无添加的特级酱油中13种氨基酸含量均高于普通特级酱油[10]，且分布更均衡，鲜味不单一，营养更全面。该研究中发现无添加的特级酱油总多酚含量与普通特级酱油无明显差异，而总酚酸和4种单体酚酸含量均显著高于普通特级酱油，这可能与其更长期的发酵工艺相关。由于无添加酱油只能通过更彻底地发酵释放更多的游离氨基酸才能达到特级酱油的氨基酸态氮标准，而普通酱油可以通过外添加谷氨酸钠和酵母提取物等达到标准，因此推测无添加特级酱油的发酵周期可能更长。其主要原料之一的小麦中富含酚酸类成分，但在原料中主要以结合的形式存在，经过长周期的发酵释放的游离酚酸含量也越高。多种类的酚酸从口感角度可以调和酱油的咸度，更重要的是赋予其健康营养。由于酚酸类物质多具有酚羟基或苯烯结构，已证实生理活性广泛且易吸收[11]，如咖啡酸具有清除自由基、拮抗内皮素的活性，从而起到双重保护血管内皮、调节血管舒张收缩正常的作用[12]；阿魏酸具有增强造血机能、抗心肌缺血和预防辐射损伤等作用[13]。亦有研究表明[14]，葡萄酒预防心脑血管疾病的活性与酚酸具有相关性，其含有的酚酸种类与酿造酱油相似，陈建业等[14]研究3款国产干红的总酚酸含量均在60 mg/L左右，高于普通三级酱油，但远低于特级酱油，干白的酚酸含量则更低。目前尚无从酚酸角度对不同级别酱油的系统研究和全面评价，在这方面的研究有待深入，为酿造酱油的质量控制和评价提供新思路。

该研究建立了一种同时测定酱油中10种酚酸含量的高效液相色谱分析方法，试验结果表明该方法操作简便、准确度和重复性好。3个样品的酚酸种类相似，无添加特级酿造酱油的总酚酸含量显著高于普通特级酿造酱油和三级酱油。

参考文献

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