不同品系金银花质量评价

谭政委　夏伟　许兰杰

摘要[目的]评价不同品系金银花药材质量。[方法]采用HPLC和紫外分光光度法测定相同产地5个不同品系金银花药材成分绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草素和总黄酮的含量，采用方差分析、相关性及主成分分析方法对5个品系金银花成分间的差异及相关性进行评价。[结果]相关性分析中，绿原酸与木犀草苷，异绿原酸A与异绿原酸C，异绿原酸A和异绿原酸C与总黄酮均呈现显著正相关，相关系数分别为0.648、0.833、0.690和0.636；异绿原酸A和异绿原酸C与木犀草素，芦丁和木犀草素与总黄酮均呈显著负相关，其相关系数分别为-0.081、-0.688、-0.476和-0.595。主成分分析综合评价中豫金2号（YJE）金银花评分较高，其次为豫封3号（YFS）金银花，评分中排序最低的为由山东引种的北花1号（BHYH）金银花。[结论]通过对5个品系金银花药材内在成分进行评价，为金银花药材质量的评价、指导金银花规范化种植及新品系的选育提供理论依据。

关键词金银花；内在成分；质量评价；主成分分析

中图分类号R284文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0168-04

Quality Evaluation of Honeysuckle in Different Strains

TAN Zhengwei， XIA Wei， XU Lanjie et al

（Sesame Research Center， Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract[Objective] The research aimed to evaluate the quality of different strains of honeysuckle. [Method]HPLC and UV spectrophotometry were used to determine the contents of chlorogenic acid， rutin， Luteoloside， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， luteolin and total flavonoids in five different strains of honeysuckle in the same place.The differences and correlations between the five honeysuckle components were evaluated by analysis of variance， correlation and principal component analysis.[Result]In the correlation analysis，chlorogenic acid and mignonette glycosides， isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C， isochlorogenic acid A and total flavonoids ，isochlorogenic acid C and total flavonoids were significantly positive correlation，the correlation coefficients were 0.648， 0.833， 0.690 and 0.636， respectively；Isochlorogenic acid A and luteolin， isochlorogenic acid C and luteolin， rutin and total flavonoids， luteolin and total flavonoids were significant negative correlation，the correlation coefficients were -0.081，-0.688，-0.476 and -0.595， respectively. Through the main component analysis，the YJE score was higher， followed by YFS， and the lowest ranking in the score was BHYH.[Conclusion]By evaluating the internal components of five strains of honeysuckle medicinal materials， it provides a theoretical basis for the evaluation of the quality of honeysuckle medicinal materials， the standardization of honeysuckle planting and the breeding of new strains.

Key wordsHoneysuckle；Inner composition；Quality evaluation；Principal component analysis

金銀花为传统大宗药材之一，主要来源于忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花[1]。忍冬史载于《肘后备急方》，首次以金银花入药记载于《救荒本草》[2-3]。传统意义上金银花具有清热解毒、疏散风热等功效，主要应用于风热引起的感冒。现代研究表明，金银花主要含有挥发油类、黄酮类和有机酸类等成分，具有解热抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆等作用[4-5]。金银花主产于我国河南、山东、河北等地，且以河南产“密银花”“封丘金银花”与山东产“济银花”较为道地[6]。根据对金银花文献查阅可知，不同品系、不同产地金银花内在质量会有所不同。

长期以来金银花主要以人工栽培为主，品系的退化、病虫害的蔓延、产地的迁移、管理水平的不规范，使得金银花品系退化、产量下降、质量降低。提高金银花的质量及产量成为迫切需要。笔者以河南省农业科学院现代农业研究开发基地（113°42′24″E，35°00′36″N）内不同品系金银花为研究对象，根据不同品系金银花内在活性成分及总黄酮为指标进行评价，优选优良品系金银花，为更好地发展利用、保护金银花种质资源及选育金银花新品系提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试材。金银花采自河南省农业科学院现代农业研究开发基地，采用随机定株采样的方法，经河南省农业科学院梁慧珍研究院鉴定为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾。样品信息见表1。

1.1.2试剂。对照品绿原酸（东京化成工业株式会社，批号EBWZE-MS，纯度>98.0%）；芦丁（国药集团化学试剂有限公司，批号20160725，纯度>95%）；木犀草苷和木犀草素（aladdin，批号分别为J1624002、H1617004，纯度>98%）；异绿原酸A和异绿原酸C（成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-17030621、MUST-17021603，纯度分别大于98.82%、99.84%）；色谱级甲醇（J.T.Baker）；色谱乙腈（J.T.Baker）；色谱甲醇（天津四友化学有限公司）；无水乙醇（天津四友化学有限公司，分析纯）；无水三氯化铝（天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯）；亚硝酸钠（天津市大森化工产品销售有限公司，分析纯）；氢氧化钠（天津市华东试剂厂，分析纯）；纯净水为哇哈哈纯净水。

1.1.3仪器。Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括二元泵，自动进样器，DAD 紫外检测器）；美谱达UV-3200紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；KQ3200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1HPLC法测定活性成分[7-8]。

1.2.1.1色谱条件。

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） ，流动相为乙腈（B）-0.3%磷酸水溶液（A）；梯度洗脱：0～11 min，90～82A；11～30 min，82～80A；30～40 min，80A；40～50 min，80～75A；50～60 min，75～70A；体积流量1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长348 nm，柱温30 ℃。

1.2.1.2混合对照品溶液制备。分别精密称取绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C和木犀草素对照品于10 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，得到各成分浓度分别为0.646、0.290、0.400、2.980、0.100、0.190 mg/mL的混合对照品溶液。

1.2.1.3供试品溶液制备。将金银花样品用电热恒温鼓风干燥箱烘干，后将其粉碎、过筛后，称取样品粉末0.5 g于三角瓶中，加入25 mL 70%甲醇溶液，摇匀，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）40 min，摇匀过滤，得供试品溶液。

1.2.1.4线性关系考察。

精密量取适量混合标准品溶液，加70%甲醇分别稀释0、3、5、7、10、20倍，摇匀，分别按照“1.2.1.1”色谱条件依次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y）、对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归。

安徽农业科学2018年

1.2.1.5精密度试验。

精密吸取混合标准品溶液，按“1.2.1.1”色谱条件将所得溶液经0.22 μm有機微孔滤膜过滤后，连续进样6次、每次10 μL进行测定，记录峰面积并进行计算。

1.2.1.6重复性试验。

精密称取同一批金银花样品6份，按“1.2.1.3”方法平行制备成6份供试样品溶液，按“1.2.1.1”色谱条件进样10 μL进行测定，记录峰面积并计算各成分的含量，然后计算RSD值。

1.2.1.7稳定性试验。

精密称取一份金银花样品，按“1.2.1.3”方法制备供试样品溶液，按“1.2.1.1”色谱条件检测，分别于0、4、8、16、24、32 h进样10 μL进行测定，并记录各成分峰面积，按照峰面积计算RSD。

1.2.1.8加样回收率试验。

精密称取已知6种成分含量的同一金银花样品6份，分别加入适量的6个成分标准品，并按照“1.2.1.3”方法制备供试样品溶液，按“1.2.1.1”色谱条件进样10 μL进行测定，记录峰面积并计算加样回收率。

1.2.2紫外-可见分光光度计测定总黄酮。

1.2.2.1金银花提取液的制备。精确称定金银花粉末（过4号筛）0.25 g，加入50%的乙醇25 mL，50 ℃条件下超声（150 W，40 kHz）浸提处理35 min后过滤，得到的澄清过滤液体即为金银花提取液。

1.2.2.2总黄酮的测定及标准曲线的绘制[9]。以芦丁为标准样，用紫外分光光度计法测定金银花提取物的总黄酮含量，在510 nm波长处比色定量测定黄酮含量。具体步骤为：准确称取于120 ℃干燥至恒重的芦丁0.020 7 g，用甲醇定容至100 mL，得浓度0.207 mg/mL的标准应用液。准确吸取标准应用液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于6支具塞试管中，加30%乙醇至5 mL再加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，摇匀放置6 min；加入0. 3 mL 10% A1Cl3溶液，摇匀并放置6 min后加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液；加入0.4 mL水，摇匀放置15 min；于510 nm波长处测定吸光度，绘制吸光度（y）–浓度（x）的标准曲线。

1.2.2.3金銀花黄酮样液的测定方法。准确吸取0.5 mL提取液并依据“1.2.2.2”测定方法进行测定，同时以实际空白组做对照，于510 nm波长处测定其吸光度，具体计算参照樊琛等[9]的总黄酮含量计算。

2结果与分析

2.1HPLC方法学考察

2.1.1线性关系考察。由表2可知，各对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好。

2.1.2精密度试验。按照“1.2.1.5”操作，计算得出绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C和木犀草素相对应

的RSD值分别为0.33%、0.58%、0.24%、0.15%、128%、0.26%，表明该方法精密度良好。

2.1.3重复性试验。按照“1.2.1.6”操作，计算得出绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C和木犀草素的RSD值分别为0.65%、0.261%、1.22%、0.47%、1.09%和203%，表明该测定方法的重复性良好。

2.1.4稳定性试验。按照“1.2.1.7”操作，计算得出绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C和木犀草素的峰面积的RSD分别为0.63%、2.91%、2.29%、0.70%、1.51%和2.83%，表明供试样品溶液在32 h内稳定。

2.1.5加样回收率试验。按照“1.2.1.8”操作，结果发现（表3），绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C和木犀草素的RSD分别为2.21%、2.53%、2.62%、2.76%、199%和2.45%。

2.2总黄酮的标准曲线绘制以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线（图1），得出回归方程y=11.564x+0002 3（R2=0.999 6）。

2.3不同品系金银花6种成分及总黄酮结果

对河南省农科院药用植物基地内不同品系金银花随机选取5～10株，选择开花期一致的金银花采样，并将其在45 ℃烘干，打粉，过4号筛，依据HPLC方法及总黄酮检测方法对不同品系金银花6种成分及总黄酮进行测量，结果见表4。

由表4可知，不同品系金银花所含化学成分有所差异，但就药典规定测定的绿原酸、木犀草苷而言，品系间差异无显著性；芦丁含量，YFY与其他品系间差异显著；异绿原酸

A、异绿原酸C、木犀草素和总黄酮含量，品系间也存在一定的差异性。

2.4金银花中6种成分、总黄酮间的相关性分析

金银花在代谢过程中，往往会存在一定的相关性，这也为金银花化学成分合成代谢及直观分析金银花提供可能性。由表5可知，金银花各化学成分间有一定的相关性，绿原酸与木犀草苷、异绿原酸A与异绿原酸C、异绿原酸A和异绿原酸C与总黄酮均呈极显著正相关，相关系数分别为0.648、0.883、0690和0.636；芦丁与总黄酮含量呈显著负相关，相关系数为-0.476；异绿原酸A和异绿原酸C与木犀草素、木犀草素与总黄酮含量均呈现极显著负相关，相关系数分别为-0.810、-0.688和-0.595。

2.5不同品系金银花主成分分析计算相关系数的特征值和方差贡献率，第1、2、3主成分的累计方差贡献率为89565%，所以选取3个主成分进行评价即可，它代表了不同品系金银花所测指标89.565%的信息量。

根据各成分含量（Z）和主成分计算公式可以得到线性组合如下：

成分1得分：F1=0.340 8×Z（绿原酸）+0.299 7×Z（芦丁）+0.207 3×Z（木犀草苷）-0.408 4×Z（异绿原酸A）-0.271 5×Z（异绿原酸C）+0.514 8×Z（木犀草素）-0.495 7×Z（总黄酮）

3讨论

由HPLC与紫外分光光度法对同一产地5个品系金银花结果可知，5个品系金银花所含化学成分各有差异，绿原酸与木犀草苷间含量虽有差异，但差异不显著，而其他4种成分及总黄酮含量，不同品系金银花存在差异且差异显著，说明绿原酸与木犀草苷含量在这5个品系间具有一定的一致性，其他成分的差异表明品系间的差异。

各成分间相关性分析结果可知，不同成分间均呈现一定的相关，其中绿原酸与木犀草苷、异绿原酸A与异绿原酸C、异绿原酸A和异绿原酸C与总黄酮在这5个品系金银花中呈现显著正相关，相关系数分别为0.648、0.833、0.690和0636；异绿原酸A和异绿原酸C与木犀草素、芦丁和木犀草素与总黄酮在5个品系金银花中均呈现显著负相关，其相关系数分别为-0.081、-0.688、-0.476和-0.595。由以上结果可以表明，在评价这5种品系金银花时，绿原酸可以在一定程度上代表木犀草苷，异绿原酸A在一定程度上反映出异绿原酸C、总黄酮与木犀草素的含量；另利用芦丁与木犀草素指标成分在一定程度上可以预测这5个品系金银花总黄酮含量。5个品系金银花内在成分相关性分析结果亦说明金银花7个成分代谢存在一定的相互依存、相互促进或抑制的关系。

由5个品系金银花内在成分对其进行主成分分析，结果显示，综合评价中豫金2号金银花评价最高，其次为豫封3号金银花，评价中排序最低的为由山东引种的北花一号金银花。由主成分结果可知，金银花内在质量存在差异，这可能与其品种的特异性及地理气候的影响有关，这为今后各地区引种金银花适宜性评价提供了很好的试验证据。

该试验通过对5个品系金银花进行方差分析、相关性分析可知，5个品系金银花所含成分均有所差异，且各成分间存在一定的相关性；通过主成分分析对5个品种金银花综合评价，说明各品系金银花之间存在一定差异。综上所述，通过对5个品系金银花药材内在成分及品系进行评价，为金银花药材质量的评价、指导金银花规范化种植及新品系的选育提供理论依据。

参考文献

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