柴达木盆地托素盐碱湖真菌多样性研究

王龙　宋维君　刘霍

摘要[目的]研究托素盐碱湖真菌多样性及菌群在不同环境中的适应规律。[方法]选取典型的缺氧、干旱、高海拔且具有稳定淡水补给的碱性封闭咸水湖泊托素湖为研究对象，分别对6个取自同一湖泊不同地理位置及不同盐度水体的样本提取总DNA后，对真菌16S rRNA基因进行Illumina Miseq高通量测序，研究样本中真菌群落结构差异及多样性。[结果]子囊菌门Ascomycota及担子菌门Basidiomycota为盐度较高样本中的优势真菌，而纤毛门Ciliophora及P1-31门为盐度较低样本中的绝对优势菌群。[结论]托素湖真菌群落结构复杂，类群丰富，其真菌群落结构受水体盐度及pH影响较大。

关键词真菌；多样性；托素湖

中图分类号S182文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）25-0060-04

Diversity of Fungi in Tuosu Saline Lake，Qaidam Basin

WANG Long，SONG Weijun，LIU Huo

（School of Chemical Engineering，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016）

Abstract[Objective]The diversity of fungi and the adaptability of flora in different environments were studied. [Method]The total DNA was extracted from six samples which different in salinity from different geographical locations of Tuosu Lake. The 16S rRNA gene of bacterial and archaeal were determined by using highthroughput sequencing based on an Illumina Miseq sequencing platform. [Result]The Ascomycota and Basidiomycota were dominant genus in the highsalt sample，while Ciliophora and P1-31 were more advantageous in the samples with lower salinity. [Conclusion]The fungus community in Tuosu Lake is complex in structure and rich in species. Fungal community structure appears to be highly influenced by water salinity and pH.

Key wordsFungi；Diversity；Tuosu Lake

托素湖位于青藏高原柴达木盆地，因其具有低温、高海拔、高盐度、高碱、高紫外辐射强度等特征，可作为一种典型的极端水环境，在以托素湖为代表的高原湖泊极端生态环境中，微生物物种结构及多样性方面具有很高的研究价值。湖泊中微生物的多样性及其群落结构组成是评价其所在生态系统健康稳定的重要指标[1-3]。高原湖泊中的微生物易受高原环境的影响，因此开展高原湖泊中微生物菌群结构及物种多样性研究能更好地了解高原湖泊生态系统中微生物资源与环境变化之间的相互关系，具有重要的研究意义。作为水体微生物的重要成员，高原湖泊中的水生真菌（aquatic fungi）具有十分重要的生态功能，并与其他细菌、古菌等微生物一起推动着湖泊生态系统的能量流动和物质循环，维持生态系统的正常运转，是生态系统中重要的组成部分[4-5]。近年来，科学工作者对各种湖泊生态系统中的真菌种类和构成进行了研究，对丰富真菌资源、开发新的功能菌株和维护水体生态系统及整个生态系统的健康发展都起着积极的推动作用。

水生真菌是指生长在淡水和海水中的真菌，生活在水体中并能完成生活史的真菌。狭义的水生真菌仅指淡水真菌。由于长期适应水这个特殊生态环境，它们形成能在水中游动的游动孢子、游动配子、游动合子以及便于漂浮和栖息的丝状孢子、四枝孢子、星状孢子等[4]。广义的水生真菌包括淡水真菌、海水真菌和污水真菌。在全球水体面临污染的今天，不管是鉴别污水还是处理污水，或是在探讨真菌的起源和演化中，水生真菌的研究都非常重要。水中基物，水层深浅，以及水的清浊、光线、温度、氧、酸碱度、水域海拔等都对水生真菌的分布产生影响。因此，对托素湖真菌多样性及其分布进行研究可揭示微生物的多样性及菌群在不同环境中的适应规律，为更好地探索开发高原微生物资源提供生物学依据。

1材料与方法

1.1采样点简介托素盐碱湖位于青藏高原柴达木盆地东部，湖区属于荒漠半荒漠的大陆性气候，冬长夏短，干旱少雨，年平均气温3 ℃，7月平均气温16.7 ℃，平均海拔2 800 m，年降水量100 mm，由于地处高原，日照充足，紫外线辐射强度较高，年辐射量572 kJ/cm2，托素湖水主来源于其北部淡水湖泊克鲁克湖的补给，两湖有河道相通。托素湖周皆为茫茫戈壁，仅在河道入湖处有稀疏的芦苇和少量的浮游生物，湖区有零星白刺等植物。

试验于2016年9月分别在托素湖河道入口处沿水流方向采集样品，具体采样点位物理化学性质见表1。用分层水质采样器取表层和底层水混合，取200 mL湖水，然后抽滤到0.22 μm的聚碳酸酯膜上，在基因組DNA提取前，将滤膜放于-20 ℃低温冰箱保存。采集T-a、T-b、T-c、T-d、T-e、T-f共6个点0～10 cm表层沉积物样品，取每点的3个平行泥样混合密封好后放入车载低温保温箱储藏，带回实验室后立即于-20 ℃冰箱保存。

1.2样品总DNA提取及16S rRNA基因PCR扩增将所采湖水及沉积物样品混匀，取出20～50 mL放入无菌离心管中，分别标记，室温12 000 r/min离心20 min，缓缓弃去上清液，将离心管底部沉淀与剩余的少量液体混合均匀后转移至2 mL无菌离心管中，室温12 000 r /min再离心20 min，用微量移液器小心吸取并弃去上清液，留下的沉淀用于总DNA提取。总DNA的提取步骤按照 AxyPrepTM 细菌基因组 DNA 提取试剂盒说明进行，并将提取到的 DNA 立刻冷藏于-20 ℃备用。

PCR扩增过程中，引物使用SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。每个样本3个重复，同一样本的PCR扩增产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

1.3测序及分析将经过纯化检测合格的PCR纯化产物进行16SrRNA基因（V4～V5区）高通量测序，测序平台采用Illumina Miseq，测序工作交由上海美吉生物科技有限公司完成，Silva数据库比对。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平：domain（域）、kingdom（界）、phylum（门）、class（纲）、order（目）、family（科）、genus（属）、species（种）统计各样本的群落组成。

1.4不同采样点水体理化性质测定在取样现场，利用便携式pH计测定水样pH，利用便携式盐度计测定水体总盐（TS），所有水體样本的理化性质测定工作均在取样后7 d内完成，总氮（TN）、总磷（TP）、总有机碳（TOC）的测定由上海谱尼测试有限公司完成。

安徽农业科学2018年

2结果与分析

2.1真菌群落结构分析

由图1可知，该试验所采6个样品共获得真菌种类为11界（kingdom）32门（phylum）50纲（class）63目（order）75科（family）94属（genus）118种（species），物种注释（operational taxonomic unit，OTU）数目为179。其中11个门属所占比例超过1%，子囊菌门Ascomycota （30.83%）、隐藻门Cryptomonadales（18.95%）、纤毛门Ciliophora（12.31%）、未被分类的真菌unclassified_d__Eukaryota （10.36%）、领鞭毛门Choanoflagellida （8.55%）、担子菌门Basidiomycota （5.54%）、普林藻门Prymnesiophyceae （259%）、壶菌门Chytridiomycota（2.05%）和无法归类的菌群unclassified_k__norank （1.25%）及

未明确分类的真菌norank_d__Eukaryota （1.03%）。样本中存在含量超过1224%的unclassified及norank的菌群，表明在托素湖中存在着大量尚未被鉴定和分类的真菌类微生物。

基于真菌属水平类群α多样性分析结果显示，样本Chao值为46.00～59.75，Shannon指数为1.66～2.79，Simpson指数为0.10～0.30。所有样本中，T-b样本群落多样性最高，Shannon指数为2.79，而T-a样本群落多样性最低，Shannon指数为1.66。Luo等[6]通过研究抚仙湖和滇池湖水中基质上的水生真菌，发现营养水平较低的抚仙湖真菌多样性高于营养水平较高的滇池，水生真菌多样性对于水体富营养化的此种响应在一些淡水湖泊中的微型浮游生物、大型浮游动物多样性方面均有所表现。

由图2可知，托素湖河道入湖口处的样本真菌类群与其他样本有着明显的区别。在样品T-a中，真菌主要属于纤毛门Ciliophora（47.35%）及P1-31（34.04%）门，其次为隐藻门Cryptomonadales（7.66%）和领鞭毛类Choanoflagellida（3.19%）。在盐度相对较高的几个样本中，子囊菌门Ascomycota含量相对较高，其中T-b（59.99%）、T-c（60.06%）、T-d（16.80%）、T-e（21.97%）及T-f （24.48%），而Ascomycota在样品T-a中含量仅为（0.41%）。含盐量较低的样本中优势真菌纤毛门Ciliophora在盐度含量较高的几个样本中含量有了明显下降，分别为T-b（14.27%）、T-c（12.25%）、T-d（394%）、T-e（16.13%），在样品T-f中的含量仅为（041%），P1-31（34.04%）门类真菌在盐度较高的样本中的含量急剧下降，所有高盐样本中的含量均小于0.10%，几乎可以忽略。总体而言，托素湖中真菌的分布及其群落结构与水体盐度存在密切关系。其中子囊菌Ascomycota及担子菌Basidiomycota为盐度较高的样本中的优势真菌。已有研究[7-8]表明子囊菌可能对于水体营养水平的变化具有很好的指示作用，子囊菌生长可能依赖于可溶性碳水化合物这样较易利用能源，可分解纤维素、木质素，而担子菌主要通过产生木质素修饰酶，以降解木质素为生。托素湖属典型的贫营养湖泊，湖周皆为茫茫戈壁，从碳循环角度来看，上游淡水克鲁克湖中的水草及湖区植被可为托素湖微生物提供纤维素、木质素等碳源，可以初步推测盐度较高样本中的子囊菌Ascomycota及担子菌Basidiomycota在托素湖泊生态体系中主要承担了分解纤维素、木质素的功能，其代谢产物又为后续微生物代谢提供了所需碳源。

2.2托素湖真菌系统发育分析选择科水平上分类信息对应的序列，根据最大似然法（approximatelymaximumlikelihood phylogenetic trees）构建进化树，并使用R语言作图绘制进化树，结果如图3所示。通过比较分析，结果表明托素湖真菌种类相对丰富且聚类分支复杂，结果表明这些序列主要归属于真菌界的子囊菌门（Ascomycota）：格孢菌科（Pleosporales）、酵母菌科（Saccharomycetales）、水松科（Dipodascaceae）、迷迭科（Didymellaceae）和格孢腔菌科（Pleosporales）等；担子菌门（Basidiomycota）：外担子菌亚纲马拉色菌科（Malasseziales）、外担子菌科（Exobasidiomycetes）、孢霉担子菌科（Cystofilobasidiaceae）等。

2.3托素湖真菌热图分析在属水平上对6个样品OTU进行聚类分析，结果如图4所示。结果显示T-b与T-c聚在一起，T-d与T-e聚在一起后又与T-f聚在一起，所有样本中T-a较其他样本亲缘关系远，单独分出一支，这一结果与多样性的结果较相似。从水体盐度角度分析，淡水领鞭毛类Freshwater-Choanoflageuates、环毛亚纲的Choreotrichia属、隐藻类的Kathablepharidae属在低盐样本T-a中的丰度明显高于其他樣品，而Trichocomaceae属（发菌科）、虫草属Cordyciptaceae、Guillardia属在高盐样本中属于绝对优势种属。说明真菌属的分布与水体盐度具有明显的相关性。已有研究表明[9]，盐度对木生真菌有重要影响，诸如半知菌（Phoma sp.、Macrophoma sp.、Piricauda sp.、Stagonospora sp.、Trichocladium sp.）在淡水、半咸水中大量分布，而在超过28.9‰盐度的河水中没有半知菌存在。

2.4湖水理化性质对真菌群落结构的影响图5为基于门水平的采样点、菌群、环境因子之间对应CCA分析。图中样本点的空间距离代表样本间的距离，分类型环境因子点与样本点距离代表样本受环境因子影响程度，样本点到数量型环境因子向量的投影距离代表样本受环境因子影响的程度。结果表明T-b和T-c，T-d和T-e样品点之间距离较其他点近，表明其真菌群落构成也较为相似，而T-f、T-a样品点与其余4点相对较远，T-a与其余5个样本点距离最远。说明样本T-a中的真菌群落组成与其他各点有较大差异。环境因子中，总盐度（TS）、总有机碳（TOC）、pH对样品真菌群落结构组成影响相对较大，总氮（TN）对样品中的真菌群落组成较其他因素相对较弱。子囊菌门Ascomycota，未被分类的真菌unclassified_d__Eukaryota，担子菌门Basidiomycota和无法归类的菌群unclassified_k__norank及未明确分类的真菌norank_d__Eukaryota与TS、TOC、pH呈正相关。领鞭毛门Choanoflagellida、隐藻门Cryptomonadales与TN呈正相关。Hallsworth等[10]研究表明，pH能够影响真菌繁殖体中多元醇和海藻糖的浓度，这2种物质在渗透压调节方面起着重要作用，而且其在细胞中的含量与真菌适应极端环境和提高真菌繁殖体贮藏寿命有关。

3结论

采用高通量技术对托素盐碱湖泊不同采样点6个样本中的真菌群落结构和多样性进行研究，托素湖中真菌的空间变化特征与环境因子关系密切，生态系统中环境因子的改变直接影响着真菌菌群结构及其丰度，同时真菌群落结构特征在一定程度亦反映了托素湖水体的生态环境状况。研究结果表明，子囊菌门Ascomycota及担子菌门Basidiomycota为盐度较高的样本中的优势真菌，而纤毛门Ciliophora及P1-31门为盐度较低样本中的绝对优势菌群。高原湖泊中真菌的功能特性和在群落和生态系统中所发挥的作用还需要更深入的研究，以期为农业生产、病害防治、生态保护和真菌资源开发提供更有力的依据。

参考文献

[1]

MONCHY S，SANCIU G，JOBARD M，et al. Exploring and quantifying fungal diversity in freshwater lake ecosystems using rDNA cloning/sequencing and SSU tag pyrosequencing[J]. Environmental microbiology，2011，13（6）：1433-1453.