湖羊GDF9基因多态性和产羔性能的关系

顾祝荣，郭海燕，王强，李拥军，瞿静雯，杨媛

摘要 [目的]研究湖羊GDF9基因多态性和产羔性能的关系。[方法]以湖羊为试验对象，对湖羊GDF9基因做PCR-SSCP多态性检测，分析多態性对湖羊产羔性能的影响。[结果]检测出3种基因型，定义为GG、AG、AA。基因型测序显示，在152 bp处发生了A被G碱基替换而发生突变。GG基因型频率、AG基因型频率和AA基因型频率分别为0.107、0.883和0.010。湖羊GG、AG和AA基因型的第1，2胎平均产羔数分别为2.068、2.025和1.500。3种基因型对第1胎产羔数没有影响；第2胎产羔数GG、AG与AA之间有显著性差异，表明GDF9基因对湖羊第2胎产羔数有影响。从第1、2胎的平均产羔数来看，差异不显著，但GG和AG基因型的产羔数相对AA基因型较高。[结论]GDF9基因对绵羊正常的繁殖是必需的，且该基因对湖羊产羔数有一定影响。

关键词 湖羊；GDF9基因；PCR-SSCP；产羔数

中图分类号 S826 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）06-0087-03

The Relationship between GDF9 Gene Polymorphism and Lambing Performance in the Hu Sheep

GU Zhurong，GUO Haiyan ，WANG Qiang et al （Animal Science and Technology College，Yangzhou University，Key Laboratory for Animal Genetic，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract [Objective]To study the relationship between GDF9 gene polymorphism and lambing performance in the Hu sheep.[Method]Hu sheep's GDF9 gene polymorphism was detected by PCRSSCP.The effect of polymorphism on the lambing performance of Hu sheep was analyzed.[Result] Three genotypes were detected and defined as GG，AG，AA.Genotype sequencing showed that the base A was replaced by base G at 152bp.GG genotype frequency，AG genotype frequency and AA genotype frequency were calculated， and the results were 0.107，0.883 and 0.010.The average number of two litters of GG，AG，AA genotypes were 2.068，2.025 and 1.500，respectively.The three genotypes had no effect on the first litter size.There was significant difference between GG，AG and AA in second litter and the GDF9 gene had an effect on the second litter size.From the average number of two litters，the results of variance analysis were not significant，but it also could be seen from the date that the number of litter size of GG and AG genotypes was relatively higher than litter size of AA genotypes.[Conclusion]GDF9 gene is necessary for normal breeding of sheep，and it has a certain effect on the litter size of Hu sheep.

Key words Hu sheep；GDF9 gene； PCRSSCP；Litter size

我国绵羊产业相对发达，绵羊业高产的原因之一便是其产羔的多胎性，其中湖羊的产羔性状较优，平均每年可产1～2胎，每胎产羔2～3只，有最高1胎产5只的记载[1-4]。湖羊的繁殖性状是由多种基因共同调控的数量性状，育种时较难对这一类性状进行有效的控制。随着现代科学技术的发展，人们可以利用分子标记、PCR扩增、DNA测序等技术对湖羊繁殖性状起主要作用的基因进行研究。

生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）被归类为TGFβ（transforming growth factor β ）超家族成员，也有学者称其为FecG基因，在卵母细胞分泌的众多生长因子中，它是首个被发现并相继被许多学者研究的对象[5-8]。其在人和绵羊上定位于5号染色体，在牛上定位于7号染色体，在小鼠上定位于11号染色体，在大鼠上定位于10号染色体，可编码400多个氨基酸[9-10]，对早期卵泡的生长发育有明显的调节作用[11]。对湖羊和负鼠的研究发现，GDF9基因在子宫、输卵管、卵巢等繁殖相关组织中均有较高表达，产仔数高的卵巢mRNA表达水平也较产仔数少的显著，说明GDF9基因与卵泡形成及高繁殖力性状间联系密切[12-14]。对 GDF9基因的突变位点进行检测，分别有学者发现在1 184 bp有C→T的突变，在729 bp有G→T的突变，在152 bp有A→G的突变，在790 bp有C→A的突变，分析发现多种突变对母羊的排卵数都有显著的促进作用[15-17]。还有研究显示，GDF9基因的2个突变可以显著提高宗地花猪的产仔数、产活仔数以及仔猪初生重[18]。殷昆仑等[19]对GDF9基因在不同品系小鼠中的多态性分析时，第1次发现BALB/c和ICR 这2种小鼠GDF9基因的5′ UTR和所编码的蛋白成熟区位点存在多态性，判断GDF9基因与小鼠的繁殖力密切相关。颜泉梅等[20]也在对西农奶山羊和波尔山羊的研究时发现GDF9基因存在多态性，且产仔数AA基因型极显著高于AG、GG基因型，显然GDF9基因对研究对象的产羔性能存在着未知的必然影响。许多研究都证实了GDF9基因是动物高产仔数的主要作用基因之一。

笔者对湖羊GDF9基因进行多态性检测，并分析多态性对湖羊产羔性能的影响，为湖羊品种的选育工作提供理论参考。

1 材料與方法

1.1 血样采集 供度样品来自江苏涟水县红业山羊养殖专业合作社，选取已有2胎生产记录的206只湖羊。分批次对206只湖羊进行颈静脉采血，每只采集血液3 mL左右，并相应记录其耳标号。用一次性采血盛血器采血，每次采血前在一次性采血盛血器中加入ACD抗凝剂。将采集的血样暂时存放冰盒内运输，后放在4 ℃环境下保存，提取DNA。

1.2 血样DNA提取 DNA提取方法参照天根生化科技（北京）有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒说明书，提取的DNA在-20 ℃环境下保存。

1.3 引物设计和PCR扩增、酶切及检测 根据Bodensteiner等[13]报道的绵羊GDF9基因全序设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列为上游引物： 5′-TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG-3′；下游引物： 5′-GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT-3′。

PCR反应体系为25 μL，其中血样提取物1 μg，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×12.5 μL Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，再用ddH2O补至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性60 s，引物57 ℃复性90 s，72 ℃延伸60 s，34个循环；72 ℃终延伸7 min。产物用3%的琼脂糖凝胶检测，4 ℃环境下保存。

1.4 SSCP多态性检测 取PCR产物2 μL和上样缓冲液[98%甲酰胺、10%甘油、0.025%溴酚蓝、10 mmol/L EDTA（pH8.0）、0.025%二甲苯青]5 μL于PCR管内，98 ℃变性10 min后迅速放入冰中5 min，可保持其变性状态。在14%非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr∶Bis=29∶1）中进行电泳检测，结束后用银染法显带。

1.5 DNA测序 将提取的血样DNA样本送到无锡翼和应用生物技术有限公司进行DNA测序及基因型鉴定，对所得数据进行整理和结果分析。

1.6 数据统计及分析 收集整理试验样本（湖羊）的生产记录，计算湖羊GDF9不同基因型及基因型频率。用SPSS 22.0软件处理数据，对不同GDF9基因型的湖羊产羔数进行Duncan方差分析，比较不同基因型与产羔数之间的关系。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果 将湖羊基因组用设计好的引物进行PCR扩增，对PCR产物再进行琼脂糖（3%）凝胶电泳检测，结果表明（图1）：目的条带为162 bp左右，其大小符合预期，特异性良好，能直接进行下一步SSCP分析。

2.2 SSCP检测结果 用引物的PCR扩增产物做SSCP检测，结果表明（图2）：扩增产物出现了3种基因型，判定GDF9基因在此次试验中存在多态性，将这3种基因型定义为GG、AG和AA型。从图中看出GG基因型泳道是8、9、10；AG基因型泳道是1、2、3、4；AA基因型的泳道是5、6、7。

2.3 湖羊GDF9基因及基因型测定结果 经生物公司测定，送检湖羊样本的GDF9基因存在多态性，共有3种基因型，将其分别定义为GG、AG、AA型。206个有效样本中有22个为GG基因型，182个为AG基因型，2个为AA基因型。计算GG基因型频率、AG基因型频率和AA基因型频率，结果分别为0.107、0.883和0.010，等位基因G的频率为0.917，等位基因A的频率为0.083。GG、AG和AA基因型第1、2胎的平均产羔数分别为2.068、2.025和1.500。

2.4 GDF9基因不同基因型测序结果 为确定GDF9基因的突变位点，将3种基因型的PCR产物送公司测序，测序结果表明（图3）：在152 bp处发生了A→G的突变（A152G）。

2.5 湖羊GDF9基因不同基因型频率及产羔数 GDF9基因不同基因型湖羊产羔数见表1。湖羊GG、AG、AA这3种基因型第1胎产羔数和第1、2胎平均产羔数均为差异不显著（P>0.05）。第2胎的分析结果为GG、AG与AA基因型产羔数差异显著（P<0.05），而GG与AG基因型产羔数差异不显著（P>0.05），从数据中可以看出，GG和AG基因型的产羔数相对AA基因型较高。

3 讨论与结论

繁殖育种学家在很早以前便广泛关注了羊的多胎性，对可能与这一性状相关的基因也进行了分子水平上的研究。2004年，国外学者曾经对Belclare和Cambridge这2个绵羊品种GDF9基因进行研究，发现在这2种绵羊染色体上都发生了突变，并且发现GDF9基因突变的方式与BMP15失活突变十分类似。进一步分析结果表明：携带纯合子的母羊表现不育，而携带杂合子的母羊排卵数明显提高。此次研究说明GDF9基因对绵羊正常的繁殖是必需的[15]。李碧侠等[16]在陶赛特、湖羊、萨福克绵羊这3个品种中都发现了GDF9基因的cDNA第152 bp处有A→G的转换，但在湖羊中只检测到杂合子，而对研究的基因和产羔率之间的相互关系并未阐述。周泽晓等[17]在贵州山羊GDF9基因多态性与产羔数相关性研究中，检测到外显子2的790 bp处存在突变而导致的多态性，认为此基因对贵州白山羊的繁殖力有影响，且推测与绵羊繁殖性能的方式相似。许多学者的研究都表示GDF9基因与动物的繁殖性能有很大的联系，但也有些学者得到了相反的结果，路立里等[21]在对哈萨克羊GDF9基因的PCR-RFLP多态性研究时就没有发现此基因存在多种基因型，GDF9基因对哈萨克羊的繁殖性能没有调控作用。吴丽丽等[22]也曾对湖羊GDF9基因进行研究，结果表明GDF9基因与湖羊的多胎性状没有相互关系。

该试验的样本数为206个，结果显示湖羊GDF9基因存在多态性（GG、AG和AA），GG基因型频率为0.107，AG基因型频率为0.883，AA基因型频率为0.010。对产羔数关系的分析结果显示，3种基因型对第1胎产羔数没有显著性影响，这可能与湖羊第1胎产羔数的不稳定性有关系。第2胎GG、AG与AA之间有显著性差异，表明GDF9基因对湖羊的产羔数有影响，试验结果有一定的参考价值。此次试验样本太少，供试湖羊全部来自一个羊场，未经选育，只有第1胎和第2胎的生产数据，对试验结果有一定的影响。从第1、2胎的平均产羔数来看，虽然差异不显著，但GG和AG基因型的产羔数相对AA基因型是比较高的，结合第2胎产羔数的分析结果，笔者认为GDF9基因对湖羊的多胎性存在一定的影响。如果要进一步分析GDF9基因对湖羊产羔性能的影响，需要增加样本的检测数量和采集地点，获得更多的产羔胎次数，并联合多个基因来进一步分析GDF9和湖羊产羔数的相互关系。

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