不同提取方法对佛手多糖性质和乙醇脱氢酶活性的影响

陈孝云 王洪新 吕文平

摘要 [目的]研究不同提取方法对佛手多糖理化性质及乙醇脱氢酶活性的影响，为改进佛手多糖生产方式和佛手多糖解酒研究提供依据。[方法]分别采用传统水提法、超声辅助法、微波辅助法、超声-微波协同提取法和复合酶法提取佛手多糖，探讨5种提取方法对多糖得率、糖醛酸含量、分子量、单糖组成、红外光谱和乙醇脱氢酶活性的影响。[结果]水提法和超声-微波协同提取多糖得率最高，分别为（4.26±0.21）%和（4.15±0.14）%。不同方法提取的佛手多糖分子量大小存在差异，其中复合酶法提取多糖平均分子量为617.85 kD，约是水提多糖分子量的4倍。5种多糖均呈现出典型的吡喃型多糖和α型糖苷键吸收，单糖组成均以阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖为主。超声-微波协同提取多糖对乙醇脱氢酶激活能力最强，可达（46.58±1.76）%，而传统水提多糖抑制乙醇脱氢酶活性。[结论]超声-微波协同提取佛手多糖得率高且所需时间短，对乙醇脱氢酶激活能力强，推测乙醇脱氢酶激活能力与多糖分子量大小、半乳糖醛酸连接方式有关。

关键词 佛手多糖；不同提取方法；理化性质；乙醇脱氢酶

中图分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0131-05

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of different extraction methods on characteristics and alcohol dehydrogenase （ADH） activity of finger citron polysaccharides （FCPs），which provide the references for the development of extraction methods and hepatoprotective activity of FCPs.[Method]FCPs were extracted by five extraction methods， including traditional water extraction（TWE）， ultrasonic assisted extraction（UE）， microwave assisted extraction （ME）， ultrasonicmicrowave synergistic extraction （UMSE） and compound enzyme assisted extraction （CEE）. The impacts of different extraction methods on the yield of polysaccharides， uronic acid content， molecular weight， monosaccharide composition， IR spectrum and ADH activity were investigated. [Result]The yields of FCPs extracted by TWE and UMSE were （4.26±0.21）% and （4.15±0.14）%， respectively， which were higher than other extraction methods. There were differences in molecular weight of FCPs prepared by different extraction methods. Average molecular weight of polysaccharides prepared by CEE was 617.85 kDa， about 4 times than the polysaccharides by TWE. Five polysaccharides had typical absorption for pyran polysaccharides and αglycosidic bond. Monosaccharide composition mainly included arabinose， galactose， glucose. The polysaccharides extracted by UMSE had the highest activating effect on ADH， with a percentage activation of （46.58±0.26）%， but polysaccharides extracted by TWE inhibited the activity of ADH.[Conclusion]The polysaccharide prepared by UMSE has good yield， high efficiency and highest activating effect on ADH. The activation of ADH may be due to the molecular weight and galacturonic acid connection.

Key words Finger citron polysaccharides；Different extraction methods；Physicochemical properties；Alcohol dehydrogenase

佛手[Citrus medica L. var. sarcodactylis （Noot.） Swingle]是蕓香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）植物佛手的干燥果实，又名佛手香橼、蜜罗柑、福寿橘、九爪木、佛手柑、五指橘[1]。佛手化学成分包括黄酮类、挥发油类、香豆素类、多糖等。《本草纲目》载： “煮酒饮，治痰气咳嗽；煎汤，治心下气痛。”据《归经》记载，佛手具有醒酒作用，是配制佛手中成药的主要原料。目前，文献尚未报道佛手中醒酒作用的成分。文献已报道积椇子多糖[2]、桑葚多糖[3]、玛咖多糖[4]、芦荟多糖[5]、枸杞多糖[6]、霍山石斛多糖[7]等对酒精诱导肝损伤的保护作用。笔者以佛手多糖为研究对象，进行解酒能力的初步研究。

乙醇主要在肝脏中进行消除，肝脏的主要代谢通路分别是乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase， ADH）通路和以细胞色素P4502E1为主的微粒体乙醇氧化系统通路[8]。乙醇脱氢酶是肝脏乙醇代谢的主要酶，催化乙醇转化为乙醛[9]。因此，探讨多糖对乙醇脱氢酶活性的影响具有重大意义。

多糖的提取方法主要包括热水提取法、酶法、微波辅助法、超声辅助法、酸碱提取法等[10]。近年来，超声-微波协同提取法应用于多糖提取，具有能耗低、提取效率高的特点[11]，此方法在佛手多糖的提取应用目前鲜见报道。笔者采用5种提取方法，依据文献报道佛手多糖最佳提取条件来提取多糖[12-15]，探讨多糖理化性质差异，并采用瓦勒-霍赫法测定多糖对乙醇脱氢酶活性的作用，进一步为佛手多糖解酒护肝研究提供酶学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。金华佛手，产地是浙江省金华市。无水乙醇、苯酚、浓硫酸、四硼酸钠、间羟基联苯、硫酸钾、浓盐酸、半乳糖醛酸、明胶、氯化钡、三氯乙酸、无水葡萄糖、焦磷酸钠、明胶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，均为分析纯。纤维素酶（40 000 U/g）、酸性蛋白酶（50 000 U/g）、果胶酶（30 000 U/g），均购自上海源叶有限公司。氧化型辅酶Ι（纯度≥98%）、乙醇脱氢酶（300 U/mg），分别购自Roche公司和Sigma公司。

1.1.2 仪器。

GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DL-5-B型离心机，上海安亭科学仪器厂；AVM602/WH型微波炉，飞利浦公司；YQ-1003D型超声波仪，上海易净超声波仪器有限公司；HH-4数显搅拌水浴锅，常州赛普实验仪器厂；SCIENT-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV1800全波长扫描仪，日本岛津公司；IS10傅里叶红外光谱仪，美国Nicolet公司；WFZUV-2100型紫外-可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；CW-2000型超声-微波协同萃取仪，上海新拓分析仪器科技有限公司；全波长M5型酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 预处理。

将鲜佛手切片，50 ℃烘干，粉碎后过60目筛。料液比1∶8（M/V）加入95%乙醇于圆底蒸馏瓶中，70 ℃，95%乙醇回流2 h，重复2次，使内源性酶失活，除去可溶性物质。50 ℃烘箱挥干，储存备用。

1.2.2 不同提取方法。

1.2.2.1 传统水提法。称取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸馏水，90 ℃下浸提2 h[12]。4 500 r/min离心10 min除去滤渣，收集滤液。于50 ℃旋转蒸发浓缩至100 mL。Sevage法除蛋白后，加入4倍体积 95%乙醇，于冰箱中4 ℃醇沉过夜。4 500 r/min离心 20 min，除去乙醇上清液，保留沉淀，50 ℃真空干燥，即得水提多糖（Traditional water extraction polysaccharides， TP）。

1.2.2.2 超声辅助法。参考王琴等[13]的研究，并略作修改。称取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸馏水，超声功率400 W，90 ℃，超声30 min。4 500 r/min离心10 min除去滤渣，收集滤液。其余步驟同“1.2.2.1”，即得超声提取多糖（Ultrasonic extraction polysaccharides， UP）。

1.2.2.3 微波辅助法。

称取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸馏水，微波功率550 W，微波8 min[14]。4 500 r/min离心10 min除去滤渣，收集滤液。其余步骤同“1.2.2.1”，即得微波提取多糖（Microwave extraction polysaccharides， MP）。

1.2.2.4 超声-微波协同提取法。

称取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸馏水，超声功率50 W，微波功率550 W，协同提取8 min。4 500 r/min离心10 min除去滤渣，收集滤液。其余步骤同“1.2.2.1”，即得超声-微波协同提取多糖（Ultrasonic-microwave synergistic extraction polysaccharides， UMP）。

1.2.2.5 复合酶法。

参考章斌等[15]的研究，并略作修改。称取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸馏水，采用复合酶（纤维素酶∶酸性蛋白酶∶果胶酶=1∶1∶1），酶用量1.2%，温度50 ℃，pH为5.0，酶解150 min后升温至90 ℃，灭酶15 min。4 500 r/min离心10 min除去滤渣，收集滤液。其余步骤同“1.2.2.1”，即得酶提多糖（Enzyme extraction polysaccharides， EP）。

1.2.3 理化性质测定。

1.2.3.1 佛手多糖得率。称取佛手多糖质量，采用苯酚-硫酸法[16]测定佛手多糖的含量，标准品采用无水葡萄糖，根据公式（1）计算出多糖得率。以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

多糖得率=多糖质量×多糖纯度佛手粉质量×100%（1）

1.2.3.2 佛手多糖糖醛酸含量测定。采用间羟基联苯比色法[17]测定佛手多糖的糖醛酸含量。

1.2.3.3 佛手多糖硫酸根含量测定。采用硫酸钡比浊法[18]测定佛手多糖的硫酸根含量。

1.2.3.4 佛手多糖蛋白质含量测定。采用考马斯亮蓝方法[19]测定。

1.2.3.5 佛手多糖分子量测定。采用高效凝胶色谱法测定，配制2.0 mg/mL的多糖溶液，用0.22 μm无菌滤膜过滤，取过滤后上清液待用。采用Waters1525 高效液相色谱仪（配2414示差折光检测器和Empower 3工作站），色谱条件：柱温45 ℃；0.1 mol NaNO3为流动相，流速0.9 mL/min；色谱柱UltrahydrogelTM Linear，其中柱长300 mm，直径为7.8 mm。配制一系列不同分子量的葡聚糖溶液作为标样，做标准曲线。样品的分子量根据其相应的洗脱体积对照标准曲线进行计算。

1.2.3.6 佛手多糖单糖组成测定。

采用高效阴离子交换色谱法，称取5 mg多糖样品于5 mL安瓿瓶中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸，吹氮气，密封，121 ℃烘箱水解3 h，用水定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤后供进样分析。色谱条件：CarboPac PA20色谱柱；脉冲安培检测器；流动相为水，250 mmol/L NaOH，1 mol/L CH3COONa。流动相洗脱程序：0～21.0 min，97.4%水，2.6%NaOH溶液；21.1～30.0 min，92.4%水，2.6%NaOH溶液，5.0%CH3COONa；30.1～50.0 min，20%水，80%NaOH溶液；流速均为0.5 mL/min。

1.2.3.7 红外光谱。采用KBr压片法，多糖样品和干燥KBr以1∶50混合，在玛瑙研钵中混合研细均匀，在压片机中压成薄片，在4 000～500 cm-1扫描[20]。

1.2.4 佛手多糖对乙醇脱氢酶活性影响。

采用瓦勒-霍赫（Valle & Hoch）法[21]，并略作修改，来检测ADH活性。试管中依次加入0.75 mL pH 8.8重磷酸钠缓冲液、0.5 mL NAD辅酶溶液、0.25 mL乙醇和50 μL多糖样品（pH 7.5磷酸盐缓冲液配制），25 ℃保温5 min。加入50 μL酶溶液，摇匀。立即吸取200 μL，加入酶标板测定，在连续5 min内，每隔10 s读取波长340 nm处的吸光度，直至每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。空白组，以50 μL pH 7.5的磷酸盐缓冲液代替50 μL多糖样品，其余步骤同上。采用以下公式计算ADH活性和激活率。

式中，E为ADH的酶活力（U/mL），其中E1为样品组酶活力，E0为空白组酶活力；A为波长340 nm处吸光度每分钟的增大值；Ew为酶液中所含的酶量（mg/mL）；1.6为反应液的总体积（mL）；6.2为NADH的克分子吸光值系数；Q为ADH的激活率（%）。

1.3 数据统计分析 试验测定的结果采用平均值±标准差（±S）表示，所有数据采用SPSS 20统计软件进行单因素方差分析，显著性检验（P<0.05）以最小显著性差异法（LSD）进行。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对佛手多糖得率的影响

从图1可看出，TP和UMP的多糖得率无显著性差异，分别为（4.26±021）%和（4.15±0.14）%。热水提取，提取时间长达2 h，提取温度高，有利于多糖溶出。超声-微波协同提取法综合超声的空化作用和微波的高能作用，加速多糖从固相进入溶剂的过程[22]。MP和EP的多糖得率低，分别为（3.12±015）%、（2.96±0.11）%。分析原因，复合酶法反应温度低，条件温和，未能有效提取佛手多糖。此外，微波法为间歇式加热，提取过程易产生大量泡沫，不利于佛手多糖提取。UP得率为（3.78±0.15）%，可能原因是超声辅助法对多糖提取的提取条件不佳，造成细胞壁破坏不够充分，多糖未能有效浸出。

2.2 不同提取方法对佛手多糖糖醛酸含量的影响

从图2可看出，TP和MP的糖醛酸含量最高，两者无显著性差异，分别为（16.56±0.43）%和（16.21±0.30）%；其次是UP和UMP糖醛酸含量，两者无显著性差异，分别是（13.95±0.25）%和（14.26±0.36）%；EP糖醛酸含量最低，为（12.11±0.26）%。

2.3 不同提取方法对佛手多糖硫酸根含量和蛋白质含量的影响 由表1可知，不同提取方法所得佛手多糖的蛋白质含量低，表明多糖脱蛋白效果好；多糖硫酸根含量和多糖抗氧化性密切相关，5种佛手多糖硫酸根含量均低于1%。

2.4 不同提取方法对佛手多糖分子量的影响

PDI值即重均分子量（Mw）/数均分子量（Mn），反映样品间分子量分布的宽度。从表2可看出，热水提取（TP）的平均分子量最小，分子均一性较高，推测是高温作用下，多糖大分子发生一定程度的降解。超声-微波协同提取的多糖，分散系数最高，与文献报道的特点相符合[23]。复合酶法（EP）提取多糖分子量最大，可能原因是酶反应条件温和，作用于细胞壁释放多糖，未对多糖大分子进行降解。

2.5 不同提取方法对佛手多糖单糖组成的影响 从表3可看出，TP、UP和EP以阿拉伯糖含量居多，分别占54.07%、47.24%、37.75%，其次是半乳糖，分别占15.06%、29.49%、24.79%；MP以阿拉伯糖居多，达32.47%，其次是葡萄糖，達31.39%；UMP以葡萄糖含量居多，达35.07%，其次是阿拉伯糖，达30.46%。综上所述，5种提取方法所得多糖的单糖组成均以阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖为主，这与He等[24]研究的结论相符。结合上述糖醛酸含量分析，佛手多糖糖醛酸主要以半乳糖醛酸形式存在。

2.6 不同提取方法所得佛手多糖的红外光谱

红外分析（图3）表明，5种提取方法所得多糖的红外结构表征一致，即5种提取方法所得佛手多糖具有相同的结构特点，这与不同提取方法提取桑黄多糖[25]研究相符。在3 500～3 000 cm-1处，强而宽的吸收峰是O—H伸缩振动，在3 000～2 800 cm-1的吸收峰是C—H伸缩振动，在1 200～1 000 cm-1是C—O—H的伸缩振动和C—O—C糖苷键振动，这些表明样品为多糖[26]。5种多糖均在1 742和1 616 cm-1左右出现吸收峰，推断是糖醛酸存在下，羧基基团的C=O键的伸缩振动与糖醛酸含量测定结果相符合[27-28]。1 408 cm-1附近宽的吸收峰，与C—H键的变形振动有关系。1 234 cm-1的吸收峰，是由于S=O的伸缩振动，表明多糖含有硫酸基团[29]。1 200～1 010 cm-1出现强吸收峰，表明存在吡喃糖苷键。831 cm-1处是α型糖苷键特征吸收峰[30]。921和762 cm-1分别是吡喃环的非对称和对称伸缩振动。

2.7 不同提取方法所得佛手多糖對乙醇脱氢酶活性的影响

由图4可知，多糖浓度在1.0～10.0 mg/mL时，随EP、UP、MP和UMP浓度升高，ADH激活率先增加再降低。当UMP浓度在2.5 mg/mL时，对ADH激活效果最好，激活率可达（46.58±1.76）%；

当EP浓度在2.5 mg/mL，ADH激活率可达（35.79±1.55）%；当UP浓度为5.0 mg/mL时，ADH激活率可达（28.35±1.04）%；MP浓度为5.0 mg/mL时，ADH激活率可达（21.52±0.96）%。 TP多糖浓度为1.0～10.0 mg/mL时，ADH抑制率随TP浓度升高而增加；TP浓度为10.0 mg/mL时，ADH抑制率达（18.60±1.02）%。

有文献报道不同酶法提取桑葚多糖对ADH活性的影响[31]，笔者研究不同提取方法所得佛手多糖对ADH活性的影响。目前关于多糖影响ADH活性的研究，主要有非共价结合[32]和离子作用[33]2种机理。EP、UP、MP、UMP和ADH非共价结合形成复合物，提高ADH反应速率起到激活作用。随多糖浓度逐渐增大，体系中硫酸基团等阴离子含量增加，作用于ADH、NAD的结合区，对ADH活性起到抑制作用。结合不同提取方法多糖理化性质分析比较，推测TP、EP、UP、MP、UMP对ADH活性差异可能是由于糖醛酸连接位点不同[34]，以及TP分子量大小与其他4种多糖差异较大造成的[35]。

3 结论

该研究探讨了5种提取方法对佛手多糖理化性质和乙醇脱氢酶活性的影响，研究发现这5种提取方法对多糖得率、分子量、糖醛酸含量和乙醇脱氢酶活性影响较大，对单糖组成有一定影响，对多糖红外结构无显著性影响。该研究首次采用超声-微波协同提取法提取佛手多糖，研究发现该法提取多糖得率高，所需时间短，多糖对乙醇脱氢酶激活能力强。该研究还比较了不同提取方法提取佛手多糖对乙醇脱氢酶活性的影响，结合多糖理化性质，推测佛手多糖半乳糖醛酸连接位点以及多糖分子量大小对乙醇脱氢酶活性有重要影响。

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