副溶血性弧菌外膜蛋白K的多表位串联表达研究

张玉晴 汪天杰 许晓升

摘要 [目的]设计和表达OmpK蛋白的多表位串联肽，综合评价其免疫效应。[方法]构建重组表达质粒pET-32a-repis并进行原核表达，使用Ni-NTA纯化介质对表达产物进行纯化得到重组多表位串联肽（rEPIS），以rEPIS为免疫原免疫昆明小鼠，对rEPIS进行免疫原性和免疫保护性研究，Western-blot分析rEPIS的免疫反应性。[结果]rEPIS具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生较高水平抗体，并且能够保护90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染，具有良好的免疫保护效应，Western-blot结果显示重组rEPIS能够与免疫后鼠血清进行特异性结合，具有良好的免疫反应性。[结论]该研究制备的重组rEPIS具有良好的免疫特性，为副溶血弧菌多表位疫苗的研究奠定了物质基础。

关键词 副溶血性弧菌；多表位串联肽；免疫特性

中图分类号 R378.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0061-04

Abstract [Objective]The multiepitope tandem peptide of OmpK protein was designed and expressed， and its immunological effect was evaluated synthetically. [Method]The recombinant expression plasmid pET-32a-repis was constructed and expressed in prokaryotic cells. The recombinant polyepitope tandem peptide rEPISN was purified by using Ni-NTA purification medium. Kunming mice were immunized with rEPIS. The immunogenicity and immunogenicity of rEPIS were studied. Western-blot was used to analyze the immunoreactivity of rEPIS. [Result]rEPIS has good immunogenicity， which can stimulate the body to produce a higher level of antibodies， and protect 90% of Kunming mice against Vibrio parahaemolyticus 10LD50 infection. The results of Western-blot showed that the recombinant rEPIS could specifically bind to the serum of immunized mice and had good immunoreactivity. [Conclusion]The recombinant rEPIS prepared in this study has good immune characteristics， which lays a material foundation for the study of polyepitope vaccine of V. parahaemolyticus.

Key words Vibrio parahaemolyticus；Multiepitope tandem peptide；Immune characteristics

近年來，人工海水养殖规模迅速扩大，生产集约化程度不断提高，病害已经成为制约水产养殖业健康发展的关键因素。在众多的细菌性病害中，弧菌病被公认为是鱼类养殖中最为严重的病害之一，其中副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是威胁海水养殖产业的重要病原菌之一，给水产养殖业带来了巨大的经济损失[1]。该菌侵染48种海水鱼类之多，发病率高，流行范围广，危害严重，是限制我国海洋鱼类、贝类等海洋经济动物养殖业发展的最主要因素之一。

随着人们生活水平的提高，其对水产品质量安全和环境污染问题日益关注，传统的水产养殖方式如采用各种化学药物防治病害的方式越来越受到质疑。接种疫苗能有效预防水产动物疫病发生[2]，且不污染环境、无药物残留，针对水生动物的疫苗领域研究逐渐成为热门，而接种疫苗也已成为国际现代水产养殖业的规范性生产标准。其中抗原表位是诱导特异性免疫应答的最基本结构和功能单位。表位疫苗将抗原表位作为疫苗的免疫原，去除免疫无关、免疫抑制及免疫病理等序列，可有效调控免疫应答类型，大大降低副作用，增强对机体的免疫保护效力[3]。该研究前期筛选了副溶血弧菌的保护性抗原外膜蛋白（outer membrane protein，omp）K的6个B细胞线性表位，在此工作基础上，设计OmpK的多表位串联体，并进行原核表达，对其进行免疫特性研究，为渔用新型多表位疫苗的开发研究奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

副溶血性弧菌标准菌株 ATCC17802、E.coli Rosetta（DE3）由汕头出入境检验检疫局技术中心实验室保存；原核表达载体pET-32a（+）购自Novagen；副溶血性弧菌阳性血清、阴性血清、重组OmpK蛋白和His-Taq标签蛋白均由笔者所在实验室制备。

1.2 主要试剂

核酸限制性内切酶（BamH Ⅰ、Hind Ⅲ）、ExTaq聚合酶和T4连接酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和质粒纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；未预染标准蛋白和预染标准蛋白为北京康为世纪生物科技有限公司产品；Ni-NTA纯化介质购自南京金斯瑞生物科技有限公司；过硫酸铵、TEMED、β-巯基乙醇等购自美国BBI公司；基因序列合成由通用生物系统（安徽）有限公司完成；引物合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 OmpK蛋白多表位串联肽的设计。

实验室前期通过应用DNAStar Protean软件预测副溶血性弧菌标准菌株 ATCC17802的OmpK蛋白的6个B细胞线性表位，将该6个表位序列用GGGS（甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸）接头连接后，转化为核苷酸序列（命名为repis），并在序列5′加上BamH Ⅰ酶切位点、保护性碱基（CGC）和起始密码子（ATG），在3′端加上Hind Ⅲ酶切位点，保护性碱基（GGG），且经密码子优化后，将最终设计的核苷酸序列送至通用生物系统（安徽）有限公司合成并克隆至质粒pET-32a（+），形成重组质粒pET-32a-repis。

1.3.2 pET-32a-repis的原核表达及纯化。

将重组质粒pET-32a-repis转化至E.coli Rosetta（DE3）中，按照质粒纯化试剂盒说明书提取重组表达质粒pET-32a-repis进行PCR鉴定。上游引物P1为5′-ATGGATATCCACAAAAACGAT-3′；下游引物P2为5′-AGATTCTGGTTTGTGACCAGAACC-3′。PCR反应体系（50.0 μL）包括10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，P1/P2各1 μL，ExTaq酶0.2 μL，ddH2O 37.8 μL，质粒模板1.0 μL。 PCR反应条件为95 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，共25个循环；72 ℃ 后延伸 10 min。将PCR阳性质粒送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序鉴定。

挑取鉴定阳性的重组菌pET-32a-repis/Rosetta（DE3）单菌落于5 mL 含100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养12～14 h后，取2 mL菌液加入到200 mL LB培养基（Amp+Cl抗性）中扩大振荡培养至OD600为0.4～0.5时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L，转16 ℃继续振荡培养16 h。离心收集菌体沉淀，用PBS重悬沉淀，加入PMSF（工作浓度为1 mmol/L）和溶菌酶，反复冻融3次后进行超声裂解（采用300 W，超声4 s，停8 s，总计20 min），使菌体充分破碎。将超声后的样本离心分离沉淀与上清，上清即为可溶性部分，沉淀为包涵体部分，用同样体积20 mL的PBS重悬。沉淀和上清各取8 μL进行SDS-PAGE检测，进行表达产物的鉴定及表达形式分析。使用Ni-His resin亲合层析柱对表达产物进行亲和纯化。

1.3.3 OmpK多表位串联肽rEPIS的免疫保护性。

将昆明小鼠随机分为5组，第1～4组分别为rEPIS组、重组OmpK蛋白组、灭活副溶血性弧菌菌苗组和标签蛋白组，第5组为PBS对照组，每组20只。3种蛋白的免疫剂量为2 μg/g体重，首次免疫时，灭活菌苗的免疫剂量为1×10.8 CFU/只，免疫途径为腹腔注射，蛋白与弗氏不完全佐剂按照1∶1混合乳化。14 d后加强免疫1次，加强免疫时，蛋白与弗氏完全佐剂按照1∶1混合乳化，剂量同一免，对照组注射等量PBS。分别于免疫前和免疫后14 d和28 d，对各实验组小鼠进行眼眶采血，采用间接Elisa检测血清中抗体水平。免疫30 d后人工感染副溶血弧菌，感染劑量为10LD50。记录实验小鼠14 d的存活情况，计算免疫保护率=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%。

1.3.4 重组多表位肽rEPIS的免疫反应性。

纯化重组rEPIS蛋白先进行SDS-PAGE，电泳结束后进行Western-blot 分析。以重组rEPIS蛋白免疫组首次免疫后28 d小鼠眼眶采血分离的抗血清为一抗，对纯化重组rEPIS蛋白进行Western-blot分析。

2 结果与分析

2.1 OmpK蛋白多表位串联肽的设计

将6个表位（氨基酸序列为DIHKNDY、NEKGYAESSHDY、PGSDKAG、YDGNKKDW、DDDKGNK、GHKPES）用GGGS连接后，转化为核苷酸序列（图1）。

2.2 pET-32a-repis的原核表达及纯化

将重组质粒pET-32a-repis转化至E.coli Rosetta（DE3）后进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示在216 bp附近有1条特异性的DNA条带（图2），表明重组质粒转化成功。重组菌经IPTG诱导培养后，对表达蛋白进行了SDS-PAGE电泳鉴定和表达形式的检测，结果如图3所示，诱导后的pET-32a-repis/Rosetta（DE3）上清液中，在30 kD左右位置出现浓染蛋白条带（泳道5），符合预期的rEPIS蛋白分子量，沉淀中没有该浓染蛋白条带（泳道6），说明该诱导条件下重组rEPIS的表达形式为可溶性蛋白。

2.3 OmpK多表位串联肽rEPIS的免疫特性研究

首次免疫后第14天和第28天，从各组免疫鼠眼眶采血分离血清，分别以纯化的重组rEPIS蛋白、重组OmpK蛋白及标签蛋白His-Taq为包被抗原，采用间接Elisa方法测定特异性抗体水平。结果如表1所示，重组rEPIS蛋白和重组OmpK蛋白均能很好地刺激机体产生较高水平的抗体，标签蛋白也能刺激机体产生相应抗体，但是其抗体水平远远低于抗重组rEPIS蛋白和重组OmpK蛋白抗体水平，即2组免疫血清中的抗体以抗重组rEPIS蛋白、重组OmpK蛋白为主。

各实验组小鼠在免疫后第30天，分别用10LD50副溶血性弧菌ATCC17802株进行攻毒实验，结果发现标签蛋白组和PBS对照组20只小鼠全部死亡，重组rEPIS组小鼠存活18只，相对保护率为90%；重组OmpK组小鼠存活17只，相对保护率为85%；灭活菌组小鼠存活18只，相对保护率为90%（表2）。死亡小鼠腹部肿胀，剖检后可见肝脏肿大且颜色变黄，肠道内有黄色积液，用肝脏切面涂抹平板，四区划线分离细菌，经生化鉴定为副溶血性弧菌。

2.4 重組多表位肽rEPIS的免疫反应性

Western-blot结果显示，纯化的rEPIS蛋白能与鼠抗重组rEPIS抗体发生特异性结合反应，在30 kD处出现1条特异性免疫反应条带（图4），表明该重组蛋白具有良好的免疫反应性。

3 讨论

传统疫苗包括减毒活疫苗和灭活疫苗。减毒活疫苗免疫效果虽好，但减毒不充分，存在临床感染的风险。灭活疫苗虽然比较安全，但也有一定的毒副作用。近年来，随着分子生物学与分子免疫学的发展，出现了多种替代传统疫苗的新形式分子疫苗，如基因工程亚单位疫苗、多表位疫苗、核酸疫苗以及基因缺失疫苗等。多表位疫苗由多个保护性抗原表位制成，是一种新型亚单位疫苗，与传统疫苗相比，其具有安全无毒、稳定可控等优势。我国水产疫苗研究开发起步较晚，全国现有近30 家科研单位开展水产疫苗相关研究，涉及病毒、细菌和寄生虫等病原27 种（类）[4]。到目前为止，只有4个渔用疫苗获得国家新兽药证书，渔用疫苗的研究开发前景比较开阔。

OmpK是一种潜在的弧菌共同抗原，以OmpK为抗原基因的弧菌渔用疫苗可能具有较高的免疫保护效率[5-8]。该研究选取副溶血弧菌保护性抗原OmpK为靶标，将预测得到的OmpK蛋白的6个B细胞线性表位用氨基酸接头连接，设计多表位串联体。在进行表位串联设计时，相邻表位氨基酸的首尾部分结合可能会产生新的接合表位，会抑制原有表位诱导的免疫应答，因此需要在相邻表位间引入合适的间隔序列。以甘氨酸接头为代表的柔性接头伸展性好，自身结构简单，连接2个大分子蛋白时往往不影响各自蛋白的天然构象。2007年，Wang等[9]将鸡传染性囊病病毒的5个抗原表位用GGGS连接后进行原核表达，得到的重组蛋白r5EPIS可诱导机体产生较高水平的特异性抗体，并具有良好的免疫保护性。2013年，Tian等[10]使用接头GGSSGG将猪瘟病毒包膜糖蛋白的B细胞表位进行串联表达，获得重组多表位蛋白GST-BT22，能够与抗猪瘟的血清抗体特异性结合，且有很强的亲和力。该研究串联表位的接头选用的是GGGS，经原核表达得到的重组蛋白rEPIS免疫小鼠后28 d，ELISA检测抗体效价高达1∶1 638 400，并且可保护90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染，具有良好的免疫保护效应。

参考文献

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