运用微滴式数字PCR 技术检测转基因玉米品系的研究

周圆　单长林　李孝军　李雪松　杨赛军

摘要 [目的]运用微滴式数字PCR 技术检测转基因玉米品系。[方法]基于微滴式数字PCR平台，建立3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式数字PCR（ddPCR）检测方法。[结果]特异性试验结果显示，该法只有特定品系的靶序列才有扩增信号。灵敏度试验表明，该方法在10 pg基因组DNA用量时可定量检测到2～16个拷贝。[结论]该研究建立的3种转基因玉米品系定量检测方法特异性强、灵敏度高，可用于进出口农产品中3种转基因玉米品系成分的定量检測。

关键词 转基因玉米；微滴式数字PCR；定量检测

中图分类号 S41-33 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）14-0175-04

Study on Detection of Genetically Modified Maize Lines Using Microdrop Digital PCR Technique

ZHOU Yuan， SHAN Changlin， LI Xiaojun et al

（Zhoushan EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Zhoushan， Zhejiang 316021）

Abstract [Objective]To detect the genetically modified maize lines using microdrop digital PCR technique.[Method]Based on the droplet digital PCR platform， we established a duplex ddPCR detection method for three kinds of genetically modified maize line TC1507， MIR162， MIR604. [Result]The results of specific experiments showed that only the target sequence of a specific strain can be amplified. Sensitivity experiments showed that the method can detect 2-16 copies of 10 pg genome DNA. [Conclusion]The quantitative detection methods of the three transgenic maize lines established in this study were highly specific and sensitive， and could be used for the quantitative detection of three GM maize lines components in the import and export agricultural products.

Key words Genetically modified maize；Droplet digital PCR （ddPCR）；Quantitative detection

我国目前从美国和阿根廷进口的玉米大部分都是转基因玉米，这其中至少包括35个品系，外加多基因复合品系，品系近50个。然而，2011年我国许可进口的转基因玉米品系只有11个，至2016年增加到13个品系，进口玉米中难免会混入其他品系[1]。我国现行转基因玉米检测标准只着重转基因成分的定性检测，难以满足我国已批准的13个转基因玉米品系的定量检测，更不能满足更多的未批准的转基因玉米品系的特异性鉴定和定量检测。

目前对转基因玉米采取的检测方法主要是对一些特定转基因玉米品系的定性检测，如针对MON810建立检测Cry1Ab蛋白的ELISA检测方法[1]。凌杏园等[2]从美国进口的近60万t转基因玉米中检出了国家批准的11个转基因品系，还在全国首次从大宗原粮中检出国家未批准转基因玉米品系MON89034。这为转基因玉米品系特异性检测标准的制定打下了基础。在定量检测方面，宋君等[3]针对NK603品系建立了特异定量PCR检测方法。邓婷婷等[4]以转基因玉米品系Mir162的性状基因vip3a为靶标，建立了实时荧光PCR和可视芯片检测方法，结果表明2种方法都能特异性检测玉米Mir162 品系，其中实时荧光PCR 检测的相对灵敏度可达0.001%，可视芯片检测灵敏度达0.010%。此研究建立的方法可用于进境转基因玉米中Mir162品系的检测。

此外，转基因产品的检测技术和方法日新月异。目前在转基因检测中得到广泛应用的实时荧光PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种PCR技术，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有检测结果准确、检测周期短、特异性更强、灵敏度更高、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。2011年起，一种能进行绝对定量检测的数字PCR（Digital PCR，dPCR）也开始推广运用，其对目标序列拷贝数的定量不依赖标准曲线，且定量结果不受PCR扩增效率影响[5-7]，标志着PCR技术迈入第三代。Corbisier等[8]应用数字PCR方法成功检测转基因玉米MON810品系，并发现此方法与实时PCR结果的一致性。

笔者主要将数字PCR方法运用于转基因玉米及其加工产品的定量检测，建立起转基因玉米数字PCR检测技术体系并应用于转基因玉米加工产品的实际检测。一方面降低进境玉米携带的转基因对地区生态和人们健康带来的风险；另一方面，提高舟山口岸的检测能力，打破技术壁垒，推动企业转基因产品出口，提高舟山新区的社会、经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料

共选用13份材料，3个转基因玉米品系MIR162、MIR604、TC1507，1份非转基因玉米（表1）。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的提取。

采用Promega公司的DNA提取试剂盒（Wizard Magnetic DNA Purification System for Food）进行基因组DNA的提取，并测定DNA浓度。

1.2.2 数字PCR反应体系和反应条件。

ddPCR反应包括4个步骤，分别为配制PCR反应体系、生成微滴、PCR扩增和微滴信号读取。其反应体系为20 μL，其中2×ddPCR Super Mix10 μL，玉米品系和内参照（Zein）基因正反向引物各1 μL（终浓度500 nmol/L）、探针各0.5 μL（终浓度250 nmol/L），DNA模板（20 ng/μL）5 μL。生成微滴要用专门的微滴生成卡槽和微滴生成仪，将20 μL PCR反应体系和70 μL微滴生成油（droplet generation oil）加入专用8通道微滴生成卡槽（droplet generator DG8 cartridge），并覆盖配套胶垫（droplet generator DG8 gasket）后，置入微滴生成仪，生成微滴。

反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火1 min，40个循环；扩增结束后进行98 ℃、10 min的酶热失活。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用QuantaSoft V1.3.2软件分析试验数据。

1.2.3 检测低限试验。

每个转基因玉米品系MIR162、MIR604、TC1507均有不同质量分数（100%、10%、1%、0.1%）的样品，每个样品做2个重复扩增，按照所建立的方法进行检测低限试验。灵敏性图谱中蓝色信号代表发生扩增的微滴， 系统判读为阳性信号；灰色信号代表未发生扩增的油滴，系统判读为阴性信号；阳性信号判断标准为阴性玉米或者水对照阳性微滴数的3倍以上即为阳性微滴数。

1.2.4 特异性试验。

特异性试验共采用样品5份，其中包括常见的转基因玉米品系MIR162、MIR604和TC1507。

2 結果与分析

2.1 反应条件优化

行标SN/T 1196—2012（转基因成分检测 玉米检测方法）中检测Zein结构基因特异性方法和检测MIR162、MIR604、TC1507品系特异性方法均为单重实时荧光PCR反应，笔者直接引用这2个标准中引物探针序列，分别对MIR162、MIR604、TC1507这3个品系边界序列采用5′-FAM—3′-BHQ1荧光标记，Zein基因采用5′-HEX—3′-BHQ1荧光标记（表2），并通过优化反应体系、反应条件等，最终建立了转基因玉米品系二重数字PCR方法。

由图1可知，在退火温度为57 ℃时4组探针引物都体现出了良好的扩增图形，阴性微滴和阳性微滴（蓝色）可以明显区分开，根据微滴生成数及阳性微滴数信号强度等指标，确定57 ℃为该方法的最佳退火温度。

2.2 灵敏度（检测低限）和准确性试验结果

分别对3个品系使用阳性样品梯度稀释观察该方法的重复性并进行数字PCR检测低限试验。从图2～4可以看出，外源基因的检测基本符合稀释梯度且具有较好的重复性。

根据阳性信号判定标准，MIR162、MIR604、TC1507品系在总基因组DNA浓度稀释至10 pg时，可出现稳定的阳性扩增，内源基因Zein在基因组DNA浓度稀释至10 pg时，也出现稳定阳性信号（图5）， 故转基因玉米3个品系的检测定量低限可达10 pg，可见所建方法体系反应灵敏度较高。由表3可知，内外源基因不同浓度样品检测结果呈10倍梯度关系，定量结果准确性较高。

2.3 特异性试验结果

数字PCR扩增后，其产物经过微滴读取仪分析，除目的基因外的品系均没有扩增，特异性试验结果见图6～8。

由图6可知，FAM通道中其他转基因玉米品系均未检测到信号，而转基因玉米品系MIR162出现信号，说明MIR162品系引物和探针特异性结果很好。

3 讨论

该试验建立了针对3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的微滴式数字PCR检测方法。考虑到二重微滴式数字PCR不仅能避免单重ddPCR定量因二次取样所产生的样品内的误差，而且可以消除不同样品DNA因取样不一致而造成的样品间的误差[7]，该研究采用二重PCR反应扩增。笔者专门对反应体系和反应条件包括引物探针终浓度、最佳退火温度及内参基因的选择进行了研究，确定了引物和探针的最佳终浓度分别为500和250 nmol/L，退火温度在56～58 ℃时，扩增效果良好，最终选择57 ℃为最佳退火温度。

用于3种转基因玉米品系PCR检测的外源探针引物和内源探针引物特异性均较好，定量结果准确性高、重复性好，检测低限均可达10 pg。此外，同一品系不同含量转基因玉米的质量百分含量与拷贝数百分含量之间存在一定的线性关系，还有待下一步的试验验证。 因此，微滴式数字PCR检测方法可以应用于3个转基因玉米品系的定量检测工作。

参考文献

[1] PAUL V，STEINKE K，MEYER H H D.Development and validation of a sensitive enzyme immunoassay for surveillance of Cry1Ab toxin in bovine blood plasma of cows fed Btmaize（ MON810）[J].Analytica chimica acta，2008，607：106-113.

[2] 凌杏园，章桂明，潘广，等.进口转基因玉米品系特异性检测[J].植物检疫，2011，25（5）：40-44.

[3] 宋君，雷绍荣，刘勇，等.转基因玉米NK603品系特异定量PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2012，23（2）：238-241.

[4] 邓婷婷，黄文胜，吴亚君，等.转基因玉米Mir162品系的实时PCR及可视芯片检测方法研究[J].植物检疫，2012，26（5）：14-18.

[5] HINDSON C M，CHEVILLET J R，BRIGGS H A，et al.Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog realtime PCR[J].Nature methods，2013，10（10）：1003-1005.

[6] HAYDEN R，GU Z，INGERSOLL J，et al.Comparison of droplet digital PCR to realtime PCR for quantitative detection of cytomegalovirus[J].Journal of clinical microbiology，2013，51（2）：540-546.

[7] 张佳玲，潘广，章桂明，等.微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5[J].食品科学，2017，38（12）：246-252.

[8] CORBISIER P，BHAT S，PARTIS L，et al.Absolute quantification of genetically modified MON810 maize（Zea mays L.）by digital polymerase chain reaction[J].Analytical and bioanalytical chemistry，2010，396（6）：2143-2150.