银纳米粒子比色传感器法测定食品及水样中双酚A

顾翔源 张瑞 姜峰 贾睿 王军 朱颖越

摘要 [目的]研究一种基于银纳米粒子聚集使体系颜色发生改变的原理，建立新的生物传感器检测食品中的双酚A。[方法]采用柠檬酸还原法合成银纳米粒子并修饰核酸适配体。双酚A 與核酸适配体结合发生变构效应导致银纳米粒子聚集，其特征峰以及颜色发生变化，研究体系特定波长吸光度比值与双酚A浓度的变化关系。[结果]在最佳优化条件下，该比色法在质量浓度为0.50～50.00 ng/mL呈现良好的线性关系，检出限为0.3 ng/mL。将该检测体系应用于BPA类似物的检测，特异性较好。[结论]该方法对食品中双酚A的检测有一定的应用前景。

关键词 银纳米粒子;盐诱导;核酸适配体;双酚A

中图分类号 TB487文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0179-02

双酚A（BPA），是一种重要的化工有机原料，苯酚和丙酮的衍生物，用于合成环氧树脂、聚砜树脂、聚碳酸酯等高分子材料，也用于增塑剂、抗氧化剂、热稳定剂等化工产品。然而最受关注的是双酚A对于人类的影响[1-2]，它可通过各类食品包装材料、奶瓶、水杯、餐具，甚至是最常见的水渗入人体，作为一种环境内分泌干扰物造成人中枢、生殖、心血管系统的癌变[3-4]。为了保证食品及水样的安全，对其中BPA残留检测方法的研究具有重大意义。

目前，环境水样中BPA的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱法[5-7]、酶联免疫法[8]、分光光度法、荧光法、电化学法等[9-12]。这些方法在准确度上虽然有一定优势，但由于样品前处理时间长、对仪器要求高、操作复杂、经济成本高，一种新型快速有效的双酚A检测方法亟待被开发。

自从BPA对应的核酸适配子被筛选出来后，相较于免疫学测定方法，核酸配子具有抗体的特异性和敏感性，合成方法比抗体更加简单，在许多相关文献中已有利用BPA核酸适配子检测BPA的记录[13-15]。笔者利用盐对银纳米粒子的诱导聚集效应，利用具有特异性的单链DNA、盐、BPA之间的相互作用，构建一种新型生物传感器，灵敏高效地检测食品及水样中双酚A的含量。

1 材料与方法

1.1 试验试剂 硝酸银（AgNO3）、二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）、氯化钠（NaCl）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均为分析纯，购买于江苏强盛功能化工股份有限公司;BPA及其类似物，分析纯，购买于上海百灵威科技;试验用水均为超纯水。BPA核酸适配子ssDNA，其序列为5-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3，购买于上海生工公司。

1.2 试验仪器 UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司;旋涡振荡器，美国ScientificIndustries公司;密理博超纯水仪，北京普析通用公司。

1.3 银纳米粒子溶液的合成

将100 mL超纯水配制的0.01% AgNO3溶液装入锥形瓶中，加入磁力搅拌子，置于恒温电磁搅拌器上加热，沸腾持续2 min后迅速加入2.5 mL质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热至溶液变为淡黄色，生成银纳米粒子，继续加热10 min后停止加热，搅拌使其冷却至室温，放置在4 ℃环境中贮存备用。

配制过程中所用磁力搅拌子、玻璃器皿等均预先以王水浸泡过夜。

1.4 试验原理

银纳米粒子在盐诱导下会发生聚集，引起明显体系吸光度的改变。具有负电性磷酸骨架的特定结构的ssDNA可以通过静电吸引结合在银纳米粒子表面，使银纳米粒子分散，而且ssDNA与双酚A反应形成变构效应，其间结合力大于DNA与银纳米表面的电荷吸附效应。当体系中NaCl与ssDNA比例恰好维持银纳米平衡时，其吸光度保持不变，在加入BPA后，ssDNA从银纳米粒子上剥离下来与BPA结合，使银纳米粒子暴露在盐环境中，继而在盐诱导下，银纳米粒子发生不同程度聚集，溶液颜色改变，由黄色变为灰色，吸光度随着BPA浓度改变而改变，银纳米粒子特征峰位置和强度发生变化。基于这个原理，设计出一种新型生物传感器应用于BPA的检测。

1.5 试验方法 向2 mL离心管中加入150 μL用缓冲液（20  mmol/L ThrisHCl，pH 7.4）配制的ssDNA溶液（终浓度为8 nmol/L），再加入1 200 μL银纳米粒子溶液混匀，室温放置过夜后，加入NaCl溶液（终浓度为40  mmol/L），混匀后加入100 μL不同浓度的BPA，总定容为1 500 μL，室温放置3 min，在波长300～700 nm扫描其吸光光谱。

2 结果与分析

2.1 试验条件的优化

影响试验结果的因素包括NaCl浓度和ssDNA浓度，确定两者最适浓度可以确定检测方法的最佳结果。在银纳米溶液中加入不同浓度的NaCl溶液，引起银纳米粒子的聚集，使得A608/A418值不同。由图1可知，当控制NaCl体系浓度在40 mmol/L时，A608/A418值最大，银纳米粒子聚集程度最大。继续增加浓度，比值几乎不变。在此基础上，同理，可测得ssDNA体系浓度为8 nmol/L时，A608/A418值最小，银纳米粒子分散程度最大。由此可知，NaCl和ssDNA最佳浓度分别为40 mmol/L和8 nmol/L。

2.2 BPA标准曲线的测定

在试验条件最优的情况下，利用建立的传感器检测不同浓度梯度的BPA溶液（0.01、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 ng/mL），利用分光光度计对体系吸光度进行测量。从图2～3可看出，随双酚A浓度变化，溶液A608/A418值呈现上升趋势，且在BPA浓度为0.50～50.00 ng/mL呈现出线性变化，线性方程为 Y =0.146+0.013 4 X，线性相关系数为0.998  检测限可达0.30 ng/mL。

2.3 特异性分析

为了排除其他类似物对双酚A检测的干扰，取BPA类似物双酚B（BPB）、双酚C（BPC）、己烯雌酚（DES），利用建立的传感器进行测量。在4种物质浓度都为相同浓度（50 ng/mL）时扫描吸光度，结果如图4，通过比较分析，除了双酚A体系颜色由黄色变为灰色，且吸光度比值变化较大，其他体系几乎没有变化。

2.4 实际样品的检测

为测试建立的传感器的实际应用效果，利用纯净水加入不同量的双酚A标准品制成不同浓度的样品，用此法检测样品中BPA含量。由表1可知，测量的回收率为96%～106%，表明该方法可以用于水中双酚A的检测。

3 结论

基于一定盐浓度导致银纳米粒子聚合而使得吸光度发生较大变化和具有优异特性的核酸适配子，建立一种能快灵敏地检测水样中双酚A的比色传感器。在优化条件下，定量定性检测结果较好，并具有高选择性和特异性。与传统检测方法相比，此方法快速、灵敏、操作方便，有较好的应用前景。

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