银杏外果皮挥发油的化学组成及其抗氧化活性研究

涂小曼 刘茂林 张烁 谢光波

摘要 [目的]分析银杏外果皮中挥发油的化学成分组成并评价其体外抗氧化活性。[方法]采用溶剂冷浸法提取银杏外果皮中的挥发油，用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术分析挥发油化学组成，通过检测挥发油对DPPH和ABTS自由基的清除能力进行体外抗氧化活性的评价。[结果]从银杏外果皮挥发油中共鉴定出7种化合物，占挥发油总量的85.46 %，其主要成分为酚类衍生物（75.98 %）。挥发油的体外抗氧化活性检测显示，该挥发油对DPPH和ABTS自由基的半数清除浓度分别为4.23和2.36 mg/mL。[结论]银杏外果皮挥发油具有一定的体外抗氧化活性，该研究可为银杏外果皮的综合利用提供依据。

关键词 银杏;外果皮;挥发油;气相色谱-质谱联用;抗氧化

中图分类号 R284.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0145-03

银杏（Ginkgo biloba Linn）为银杏科（Ginkgoaceae）银杏属植物，又称为白果、公孙树、鸭脚子，为中生代孑遗的稀有树种，系我国特产[1]。银杏在我国种植范围非常广泛，具有较好的药用及食用价值。银杏叶、银杏叶提取物可用于治疗痰血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳嗽等[2]。银杏种子白果仁常见于中医用方中，具敛肺定喘、止带缩尿的功效[3]，白果仁亦作为营养保健食品常见于市场，白果炖鸡是我国一道特色传统名菜。

银杏外果皮是银杏种子硬壳外面的肉质皮层，俗称白果衣胞[3]，通常情况下只取其仁，而将外果皮丢弃，既污染环境，又浪费了资源，因而有必要对其开展研究，实现其综合利用。目前有关银杏外果皮研究多侧重于非挥发性化学成分，从中分离得到黄酮、脂肪酸、银杏酚酸等多种类型化合物，而对其挥发性成分的组成及生物活性研究则鲜有文献报道[3-5]。笔者对银杏外果皮挥发性化学成分的组成及生物活性开展了研究，旨在为更好地利用银杏外果皮提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。银杏外果皮于2017年11月收集自电子科技大学沙河校区银杏林。

1.1.2 主要仪器。HP-6890/5973型GC-MS联用仪（Hewlett-Packard，USA）;ELX 808型全自动酶标仪（BioTek Instruments，USA）;BSA124S型电子天平（Sartorius，Germany）;RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣）;DRT-TW型电热套（郑州长城科工贸有限公司）。

1.1.3 主要试剂。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma-Aldrich，USA），2，2-联氨-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS，东京化成），其他试剂均为分析纯（成都科龙）。

1.2 方法

1.2.1 挥发油的提取。取新鲜银杏外果皮破碎后，装入1 000 mL圆底烧瓶中，加入重蒸石油醚250 mL，冷浸5 d。冷浸液经无水硫酸钠干燥后，低温回收石油醚，得到具有特殊刺激性气味的淡黄色蜡状固体2.407 g，挥发油样品置于冰箱中4 ℃保存备用。

1.2.2 GC-MS测定条件。

1.2.2.1 气相色谱条件。色谱柱为HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm × 0.25 μm）;程序升温：从60 ℃开始，以10 ℃/min升到120 ℃，然后再以20 ℃/min升到220 ℃，最后以10 ℃/min升到280 ℃;进样口温度为270 ℃;载气为He;柱流量：0.8 mL/min;进样量：0.1 μL，分流比：50∶1。

1.2.2.2 质谱条件。EI离子源;电离电压：70 eV;离子源温度：230 ℃;四级杆温度：150 ℃;GC-MS接口温度280 ℃;扫描范围 20 ～ 450 Amu。

1.2.3 抗氧化生物活性测定。

1.2.3.1 DPPH法[6-7]。精确称取DPPH 5 mg，用无水乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，浓度为0.1 mg/mL，避光保存。

取96孔板，加入100 μL不同浓度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mg/mL）的挥发油乙醇溶液，然后再分别加入100 μL新配制的DPPH溶液，避光反应30 min后，用酶标仪在540 nm波长下测定其吸光度。分别以无水乙醇和维生素C作为空白和阳性对照，每个挥发油浓度重复3次。

式（1）中，Ai为不同浓度样品与DPPH溶液的混合液的吸光度;Aj为不同浓度样品与无水乙醇的混合液的吸光度;A0为DPPH溶液与无水乙醇的混合液的吸光度。

1.2.3.2 ABTS法[8]。将5 mL 7.4 mmol/L的ABTS储备液与88 μL 2.6 mmol/L K2S2O8储备液混合，避光静置12 h后得到ABTS工作母液，再用双蒸水稀释8倍后得到ABTS工作液，备用。

取96孔板，加入100 μL不同浓度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mg/mL）的挥发油乙醇溶液，然后再分别加入100 μL新配制的ABTS工作液，室温条件下静置反应10 min后，用酶标仪在波长405 nm下测定其吸光度。分别以无水乙醇和维生素C作为空白和阳性对照，每个挥发油浓度重复3次。

式（2）中，Ai为不同浓度样品与ABTS工作液的混合液的吸光度;Aj为不同浓度样品与双蒸水的混合液的吸光度;A0为ABTS工作液与无水乙醇的混合液的吸光度。

1.2.4 数据处理。样品中各挥发性成分通过与Wiley 7、NIST 05标准质谱数据库检索比对确认，采用峰面积归一化方法定量分析揮发油成分相对含量。运用SPSS软件求取清除率达到50 %时的样品浓度（IC50）。

2 结果与分析

2.1 银杏外果皮挥发油化学成分 银杏外果皮挥发油各成分的相对含量按峰面积归一化法计算并确认，其总离子流图谱如图1所示。经检索谱库并结合质谱图中基峰、质荷比一级相对丰度与标准图谱的对比，鉴定出7个组分（表1），占总峰面积的85.46 %，其中酚类衍生物占75.98 %，主要成分为白果酚（ginkgol），含量达到53.32 %。

2.2 银杏外果皮挥发油体外抗氧化能力 由图2a可知，银杏外果皮挥发油对DPPH和ABTS自由基均具有一定的清除能力，且该能力皆随着挥发油浓度的升高而逐渐增强，当挥发油浓度为40.000 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率达到97.76 %，而对ABTS自由基清除率达到84.98 %。通过SPSS软件计算得出银杏外果皮挥发油对DPPH和ABTS自由基的半数清除浓度（IC50）分别为4.23和2.36 mg/mL。与此同时，阳性对照维生素C对DPPH和ABTS自由基的IC50分别为0.018和0.046 mg/mL（图2b）。

3 结论与讨论

前期采用水蒸气蒸馏法并结合溶剂萃取进行银杏外果皮中挥发油的提取，但挥发油收率过低，因而该研究采用溶剂冷浸法。文献报道以二氯甲烷为溶剂，采用同时蒸馏萃取法得到的挥发油GC-MS分析结果显示其主成分为脂肪酸类化合物，己酸含量达到65.88 %[5]。而该研究获得的挥发油GC-MS分析结果显示虽然也含有脂肪酸（丁酸 2.70 %和己酸 1.29 %），但其主成分为酚类衍生物（75.98 %），其中白果酚含量高达53.32 %，这一成分上的差异可能和提取方法的不同相关，也可能和银杏的不同生长环境相关。此外，银杏外果皮的化学成分研究亦显示其含有酚类化合物，如白果酚、银杏酚等[9-10]。

有研究表明，银杏外果皮多糖具有提高免疫力、清除自由基、抗衰老、抗炎及抗肿瘤作用[11-15]，银杏外果皮内所含酚酸类化合物具有抗肿瘤活性[9-10]，银杏外果皮提取物亦具有抑制真菌生长的活性[16-17]。鉴于溶剂冷浸法所得银杏外果皮富含酚类化合物，笔者对其体外抗氧化活性进行了检测。研究结果表明，银杏外果皮挥发油对DPPH和ABTS自由基均显示出一定的清除活性，但明显弱于阳性对照維生素C，这是首次测定了银杏外果皮挥发油成分的体外抗氧化活性。该研究结果为银杏外果皮的综合利用提供了科学依据。

参考文献

[1]中国科学院《中国植物志》编委会.中国植物志：第7卷[M].北京：科学出版社，1978：18-22.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：316-317，416-417.

[3]唐于平，楼凤昌，王欢，等.银杏外种皮的化学成分和药理作用[J].药学进展，2000，24（3）：152-155.

[4]赵肃清，李锋，孙远明.银杏外种皮研究进展[J].武汉植物学研究，2000，18（6）：515-518.

[5]韩帅，苗志伟，刘玉平，等.银杏外种皮挥发性成分分析[J].食品科学，2012，33（14）：146-149.

[6]CHEN Y，ZHANG H，TIAN X，et al.Antioxidant potential of crocins and ethanol extracts of Gardenia jasminoides ELLIS and Crocus sativus L.：A relationship investigation between antioxidant activity and crocin contents[J].Food chemistry，2008，109（3）：484-492.

[7]XIE Y，XIE G B，CHEN B，et al.Chemical composition，antibacterial and antioxidative activities of essential oil from Ligularia pleurocaulis[J].Asian journal of chemistry，2014，26（15）：4807-4809.

[8]IRITI M，VITALINI S，APOSTOLIDES N A，et al.Chemical composition and antiradical capacity of essential oils from Lebanese medicinal plants[J].Journal of essential oil research，2014，26（6）：466-472.

[9]ITOKAWA H，TOTSUKA N，NAKAHARA K，et al.Antitumor principles from Ginkgo biloba L.[J].Chemical & pharmaceutical bulletin，1987，35（7）：3016-3020.

[10]LEE J S，CHO Y S，PARK E J，et al.Phospholipase Cγ1 inhibitory principles from the sarcotestas of Ginkgo biloba[J].Journal of natural products，1998，61（7）：867-871.

[11]顾维戎，许爱华，汪正兴.银杏外种皮对小鼠免疫功能的影响[J].扬州医学院学报，1989，1（1）：4-6.

[12]许爱华，陈华圣，王玲，等.银杏外种皮多糖对不同状态小鼠血清SOD和MDA形成的影响[J].中国中药杂志，1998，23（12）：746-747.

[13]许爱华，王玲，陈华圣，等.银杏外种皮多糖延缓小鼠衰老的实验研究[J].中药材，1996，19（9）：466-468.

[14]许爱华，顾维戎，许正新.银杏外种皮多糖的抗炎作用[J].扬州医学院学报，1991，3（1）：4-6.

[15]许爱华，陈华圣，项晓仁，等.银杏外种皮多糖对小鼠肿瘤的抑制作用[J].中药药理与临床，1996，12（5）：24-26.

[16]徐立春，童鲲，顾维戎，等.银杏外种皮中间体取物抑制真菌生长的实验研究[J].中药材，1990，13（6）：36-37.

[17]徐立春，童鲲，程鹏，等.银杏外种皮提取物对致病性真菌生长抑制的研究[J].微生物学通报，1991，18（4）：225-227.