46份粳稻品种抗稻瘟病基因的分子检测及抗性评价研究

陈培峰 乔中英 谢裕林 董明辉 伍应保 朱勇良 宋云生

摘要 [目的]对46份粳稻品种抗稻瘟病基因进行分子检测，并对其进行抗性评价。[方法]利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的功能标记对 46份育种材料进行分子标记检测，结合稻瘟病抗性接种鉴定，对基因型与表型进行相关性分析。[结果]46 个品种中携带Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因的材料分别为 18、35、22和16个，其中3个材料含有4个抗性基因;6个材料含有 3个抗性基因;25个材料含有 2个抗性基因;11个材料含有 1个抗性基因;1个未检测到抗性基因。结合稻瘟病田间抗性鉴定表明，同时含有3个以上抗性基因的材料只有2份表现为中感（MS）和感病（S），其他均为中抗（MR）以上。[结论]单一抗病基因型的抗病能力因新生理小种的出现而不稳定，抗病基因的聚合利用和新的广谱抗性基因的发掘迫在眉睫。

关键词 水稻;抗稻瘟病基因;分子标记检测;抗性评价

中图分类号 S511文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0065-03

稻瘟病是水稻重要病害之一，具有传播速度快、发生范围广、暴发频率高、危害严重等特点，在我国常年均有不同程度的发生，造成的产量损失可达40%～50%，局部田块甚至颗粒无收[1]。挖掘有效的抗病基因，通过生物技术将抗病基因导入水稻品种内快速培育出抗病水稻品种是解决水稻稻瘟病危害的重要途径[2-5]。随着分子标记技术的普遍应用，大量新的抗稻瘟病基因被定位在不同的染色体上。到目前为止，有50多个抗瘟基因（或QTLs）被定位。除了第3号染色体没有发现抗稻瘟病基因外，其他染色体上都含有1～3个抗性基因位点。许多抗稻瘟病基因被定位在第6、11和12号染色体上[6-8]，抗性基因分子标记的设计研发为抗性基因在水稻抗病育种中的开发利用提供了有效手段。但稻瘟病菌容易发生变异，同一水稻产区稻瘟菌的种群结构及生理小种经常发生变化，导致抗病品种在种植数年后，抗性水平下降甚至丧失[9-10]。通过发掘、鉴定抗稻瘟病基因资源，鉴定抗病基因，对于有效、合理地利用抗病基因资源，利用分子标记辅助选择培育持久抗稻瘟病品种有重要意义。笔者以江苏省主要利用的4个抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的分子标记对46份育种材料进行基因检测，并对材料进行穗颈瘟人工接种鉴定，通过材料的抗病表现综合评价抗病基因在育种中的利用价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种 46 份，为苏州市农业科学院水稻育种的中间稳定材料。

1.2 稻瘟病抗性田间鉴定方法

采用田间诱发的方式，用苏御糯作为感病对照品种。5月12日育秧，地宽100 cm，插秧前划行、插牌。每个品种南北方向，5行10穴插秧。在参试品种两侧插种感病诱发品种苏御糯，间隔插秧。在水稻分蘖初期，田间撒播上年收集的稻瘟病菌标样，有利于发病，在水稻基本黄熟后调查水稻穗颈瘟。按国家统一标准，检查发病情况，分级记载。

1.3 稻瘟病抗性基因的分子标记

利用Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因引物检测材料，引物名称、序列及其扩增片段预期大小见表 1。

1.4 稻瘟病抗性基因检测

采用 SDS 法提取水稻基因组 DNA。以基因组DNA 为模板进行基因片段扩增，PCR 反应体系参照范方军等[11]的方法。反应产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在紫外凝胶成像仪上观察并照相。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病田间抗性鉴定结果

由表2可知，在46 份品种中，苏2473表现为抗病（R）;苏4081、苏4088、苏5069、苏5234等 11个材料表现为中抗（MR）;苏2479、苏2483、苏5073、苏5079等21个材料表现为中感（MS）;苏2766、苏5126、苏5127、苏5283、苏5286等 13 个品种表现为感病（S）;未有材料表现为高感（HS）。

2.2 稻瘟病抗性基因检测结果

利用水稻稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的功能标记检测46份育种材料，结果表明（表2），苏2473、苏5069、苏5073、苏5079等18个材料含有抗稻瘟病基因 Pi-ta，占比为39.13%;苏2473、苏2479、苏2483、苏2766等35个材料含有抗稻瘟病基因 Pi-b，占比为76.09%;苏2473、苏2479、苏2483、苏4081 等22 个材料含有抗稻瘟病基因 Pi54，占比为47.83%;苏2473、苏5114、苏5234、苏5245等 16 个材料含有抗稻瘟病基因 Pi2 占比为34.78%。苏2473、苏6000、苏6002 这3个材料含有4个抗性基因，苏5069、苏5114、苏5234、苏5878等 6 个材料含有 3 个抗性基因;苏2479、苏2483、苏2766、苏4081等 25个材料含有 2 个抗性基因;苏5126、苏5127、苏5281、苏5348等11个材料含有 1 个抗性基因;苏5290未检测到抗性基因。

结果还表明（表3），未检测到抗性基因的1个材料表现为感病（S）;检测到1个抗性基因的材料中有7个材料表现为中感（MS），4个材料表现为感病（S）;检测到2个抗性基因的材料中有5个材料表现为中抗（MR），13个材料表现为中感（MS），7个材料表现为感病（S）;检测到3个抗性基因的材料中有4个材料表现为中抗（MR），1个材料表现为中感（MS），1个材料表现为感病（S）;检测到4个抗性基因有1个材料表现为抗病（R），2个材料表现为中抗（MR）。

3 结论与讨论

培育和利用抗病品种是目前防治稻瘟病最经济有效的措施，然而由于稻瘟病菌的致病性分化严重，生理小种多，变异频繁，给抗病品种的选育带来了困难，因此发掘、鉴定和利用抗病资源，并通过分子标记定位抗病基因，并通过标记辅助选择提高抗病品种的选择效率，对指导培育更优良的抗稻瘟病新品种具有重要的理论和实践意义。Pi-ta 、Pi-b、Pi54和 Pi21是水稻育种中重要的抗稻瘟病基因，研究表明抗稻瘟病基因Pi-ta 和Pi-b与穗颈瘟抗性存在显著相关性[11-12]。有研究发现Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm在山东及黄淮区新选育品种中分布频率较高，其中 Pi-b、Pi54、Pikm的分布频率超过或接近50%，且Pikm与稻瘟病抗性存在显著相关[13]。该研究表明，Pi-b在供试材料中分布频率较高，达76.09%，大多数材料均含有Pi-b基因，Pi-ta和Pi21的分布频率仅有35%左右。结合稻瘟病田间抗性鉴定表明，同时含有3个以上抗性基因的材料只有2份表现为中感（MS）和感病（S），其他均为中抗（MR）以上，而只含其中1个抗性基因材料中未出现中抗以上的材料。由于抗病品種的单一化以及稻瘟病菌的复杂性和易变性，单一优势抗性基因的利用极易使得稻瘟病菌群体中的毒性小种演变成为优势小种而造成水稻稻瘟病抗性丧失，因此，抗病基因的聚合利用和新的广谱抗性基因的发掘是今后水稻抗稻瘟病育种工作的重点。

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