乳酸菌降解亚硝酸盐条件的优化

赵慧娟　许梓文

摘要 [目的]研究Lyoflora V3乳杆菌对亚硝酸盐降解的影响，优化其降解条件。[方法]探讨了乳酸菌降解亚硝酸盐的影响因素，主要包括溶液pH、接种量、NaCl含量和培养时间。采用L9（34）正交试验对整体工艺进行试验条件优化。[结果]影响乳酸菌降解亚硝酸盐的各因素次序为pH>接种量>NaCl含量>培养时间，最佳降解条件：pH为3.0，接种量为5 %，NaCl含量为9%，培养时间为72 h。在最佳降解条件下，乳酸菌降解亚硝酸盐的降解率可达98.50%。[结论]该研究可为乳酸菌发酵工艺中亚硝酸盐的控制提供参考。

关键词 乳酸菌；亚硝酸盐；降解； 正交试验

中图分类号 TS201.3 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）17-0176-03

Abstract [Objective]To study the effect of Lactobacillus Lyoflora V3 on nitrite degradation and optimize its degradation conditions.[Method]Factors influencing degradation of nitrite by Lactobacillus were discussed，including pH，inoculation quantity，NaCl content and inocubation time.L9（34）Orthogonal design was adopted to optimize the overall process.[Result]The results show that the order of factors affecting the degradation of nitrite by Lactobacillus is： pH > inoculation quantity>NaCl content>inocubation time.The best conditions were pH 3.0， inoculation quantity 5% ，NaCl content 9%，inocubation time 72 h. Under the best degradation conditions，the degradation rate of lactic acid bacteria can reach 98.50%。[Conclusion]The study can provide a reference for the control of nitrite in the fermentation process of lactic acid bacteria.

Key words Lactic acid bacteria； Nitrite；Degradation；Orthogonal design

亞硝酸盐是一种潜在的致癌物质，对人体有强的毒害作用，过量摄入易诱发癌症。其由于能使食品增色和增加风味，常用作食品添加剂[1-2]。乳酸菌主要分布于矿物质和有机营养物丰富的微酸环境中，有促进营养分解、吸收的作用，是对人体健康有益的益生菌。有研究表明，乳酸菌在发酵过程中产生特殊的物质，如酶，可催化亚硝酸盐的还原，进而具有降解亚硝酸盐的作用[3-4]。

在此基础上，笔者对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响因素进行探讨，进一步分析了亚硝酸盐的降解条件，为乳酸菌发酵工艺中亚硝酸盐的控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。Lyoflora V3购自北京多爱特生物科技有限公司。

1.1.2 试剂。

0.1 mol/L HCl、饱和硼砂溶液、亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液、对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液等。

1.1.3 仪器。TU-1901双光束紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；pHS-3G型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；JA1003B分析天平，上海越平科学仪器有限公司；YXQ-SG41-280电热手提式压力蒸汽灭菌器，上海林馨医疗器材有限公司；SW-CJ-IF型净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司；BXD-YX3200台式电热恒温培养箱HHS-21-6电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.1.4 培养基。

MRS液体培养基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 pH对亚硝酸盐降解的影响。

配制好的MRS液体培养基，加入亚硝酸钠使浓度为200 mg/L，加入7%的NaCl，充分混匀。经121 ℃灭菌15 min后，调pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，接入4%的经活化2 h后的乳酸菌，于30 ℃、120 r/min恒温振荡培养48 h[5]。

1.2.2 接种量对亚硝酸盐降解的影响。

配制MRS液体培养基，加入亚硝酸钠使浓度为200 mg/L，加入7%的NaCl，充分混匀。经121 ℃灭菌15 min后，调pH为3.0，分别接入1%、2%、3%、4%、5%、6%的菌种，于30 ℃、120 r/min恒温振荡培养48 h。

1.2.3 培养时间对亚硝酸盐降解的影响。

配制MRS液体培养基，加入亚硝酸钠使浓度为200 mg/L，加入7%的NaCl，充分混匀。经121 ℃灭菌15 min后，调pH为3.0，接入4%的经活化2 h后的乳酸菌，于30 ℃、120 r/min恒温振荡培养，培养时间分别是0、24、48、72、96、120 h。

1.2.4 NaCl含量对亚硝酸盐降解的影响。

配制MRS液体培养基，加入亚硝酸钠使浓度为200 mg/L，分别加入1%、3%、5%、7%、9%、11%的NaCl，充分混匀。经121 ℃灭菌15 min后，调pH为3.0，接入4%的经活化2 h后的乳酸菌，于30 ℃ 120 r/min恒温振荡培养48 h。

1.2.5 酵母菌降解亚硝酸盐正交试验。

在上述单因素试验中，每因素筛选出3个水平进行正交试验。

1.2.6 亚硝酸盐含量的测定。采用盐酸萘乙二胺法[4]。

2 结果与分析

2.1 pH对亚硝酸盐降解的影响 根据试验结果，比较出乳酸菌在不同pH时对亚硝酸盐的降解效果。

从图1可见，在接种量、NaCl含量和培养时间不变的情况下，改变pH，乳酸菌降解亚硝酸盐的结果随之变化。由于酸可以分解亚硝酸盐[6]，当pH在3.5～4.5时，OD值波动不明显，而pH小于3.5时变化较为显著。故pH对亚硝酸盐降解的影响较大，最佳pH为3.0，故选择pH为3.0、3.5、4.0进入正交试验。

2.2 接种量对亚硝酸盐降解的影响

根据试验结果，比较出乳酸菌在不同接种量时对亚硝酸盐的降解效果。

由图2可知，当接种量为1%～5%时OD值呈下降趋势，当OD值大于5%时OD值回升，说明在此段区域内，接种量为5%结果最佳。这可能是由于接种量过少不利于亚硝酸的降解，接种量过大则会造成培养基的营养不足，影响菌株生物量的增长[7]。所以，采用4%、5%、6%的接种量作为乳酸菌降解亚硝酸盐的优化条件。

2.3 培养时间对亚硝酸盐降解的影响

根据试验结果，比较出乳酸菌在不同培养时间时对亚硝酸盐的降解效果。

由图3可知，当培养时间大于48 h后，亚硝酸盐降解的效率也随之增大，当混合菌种的培养时间为72 h时，亚硝酸盐降解的效果最好，这是由于此时处于菌种生长的最适生长期。说明可以通过控制培养时间提高亚硝酸盐降解的效率，故而选取48、72、96 h进入正交试验。

2.4 NaCl含量对亚硝酸盐降解的影响

资料显示，发酵初期食盐有抑制腐败菌生长的作用，不同盐浓度对于亚硝酸盐的降解程度具有很大影响[8]。由图4可知，当NaCl含量小于9%时，OD值随盐浓度的增加先减小，又上升再减小，总体趋势是减小的，当NaCl含量为9%时，OD值最低，此时亚硝酸盐降解效果最好，故选择NaCl含量为7%、9%、11%时进入正交试验。单因素试验证明，NaCl含量对乳酸菌降解亚硝酸盐影响较大。

2.5 乳酸菌降解亚硝酸盐条件优化结果与分析

根据上述单因素试验结果，采用L9（34）正交试验设计方法对整体工艺进行优化，结果见表1。

由表1可见，各项影响因素最佳组合为A1B1C2D3，即pH为3.0，接种量为4 %，NaCl含量为11%，時间为72 h。通过OD值比较，最佳组合为A1B2C2D2，两者不相符，进行验证试验。经试验，最佳组合为A1B2C2D2。此时，OD值为0.008，经计算，亚硝酸盐降解率为98.50%。

根据试验结果分析，各因素对降解效果的影响主次顺序为A>B>D>C，即pH>接种量>NaCl含量>培养时间。pH是最大的影响因素，这是由于乳酸可以通过与亚硝酸盐发生歧化反应，所以亚硝酸盐在酸性条件下不稳定，可以发生一定程度的自然降解，从而降低亚硝酸盐含量。其次是接种量，接种量的大小决定了菌种生长繁殖的速度，在一定范围内，采用较大的接种量可减少杂菌的生长机会，增强亚硝酸盐降解的效果。试验表明，NaCl含量对亚硝酸盐的降解也有一定影响，这可能是由于Na+与亚硝酸盐还原酶作用，利用酶催化反应将亚硝酸盐降解。当培养时间不同时，亚硝酸盐降解的效果也不相同，菌种在不同生长期的降解效果不同。

3 结论

该试验初步研究了乳酸菌对亚硝酸盐降解的效果，通过单因素试验和正交试验的方式，以OD值的变化为检测指标，考察了pH、培养时间、接种量和NaCl含量对亚硝酸盐降解效果的影响。结果表明，pH为对亚硝酸盐降解最大的影响因素。在试验条件范围内，显示其影响程度依次排序为pH、接种量、NaCl含量、培养时间。得出的最优条件为pH为3.0，接种量为5%，NaCl 含量为9%，时间为72 h。该条件下乳酸菌降解亚硝酸盐的效果最好。乳酸菌在最佳条件下能够有效降解亚硝酸盐，这对于保护环境以及维护人类健康方面具有重要意义。

参考文献

[1] 陈丽金，梁张慧，王佛娇.广东省部分基地蔬菜硝酸盐污染现状评价[J].现代农业科技，2016（10）：263-264，267.

[2] BOZKURT H，BAYRAM M.Color and textural attributes of sucuk during ripening[J].Meat science，2006，73（2）：344-350.

[3] 郝莹，孙军，曾金金，等.降解多种抗生素残留的乳酸菌的筛选鉴定及特性研究[J].中国酿造，2017，36（10）：104-108.

[4] 裴洪丽，姜韩，闵钟熳.降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选及鉴定[J].中国酿造，2013，32（3）：98-101.

[5] 顾诗雯，何婷婷，丁少男，等.乳酸菌降解亚硝酸盐的发酵条件研究[J].食品研究与开发，2013，34（12）：97-99.

[6] 叶陵，李勇，王蓉蓉，等.剁辣椒中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究[J].食品科学，2017-08-29[2018-01-20].http：//www.spkx.net.cn/CN/abstract/abstract42575.shtml.

[7] 陈中，林浩，林伟锋.植物乳杆菌在自制培养基中降解亚硝酸盐的研究[J].现代食品科技，2014，30（3）：53-57.

[8] 李文涛.降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选、诱变及复合降解条件优化[D].长春：吉林农业大学，2014.