木霉菌油悬浮剂组合施药对猕猴桃细菌性溃疡病的防治效果

叶乃玮 王承芳 耿稞 张信旺 毛伟力

摘要 [目的]探讨木霉菌油悬浮剂组合施药防治猕猴桃细菌性溃疡病的效果。[方法]通过液体发酵和剂型处理，将木霉（Trichoderma spp.）菌株Tr309T制成含2×108个/g或 2×108个/mL 分生孢子的可湿性粉剂（WP）或油悬浮剂（SC），于2016和2017年在上海卉绿农场进行单项施药（灌根、喷雾、涂抹）和组合施药[喷雾+涂抹（A）或灌根+喷雾+涂抹（B）]对比试验，测定它们对猕猴桃细菌性溃疡病的防治效果。[结果]经Tr309T-WP、Tr309T-SC所进行的单项施药处理的病情指数、防治效果和病斑治愈率，均分别显著高于或低于化学药剂处理；而经Tr309T-SC或2%溃腐灵SC的组合施药方式A或B处理的猕猴桃植株的病情指数和防治效果均分别显著低于或高于Tr309T-WP和病原对照组合施药处理。[结论]该研究结果为猕猴桃细菌性溃疡病的生物防治提供了理论依据。

关键词 猕猴桃溃疡病；油悬浮剂；木霉菌；组合施药

中图分类号 S436.634.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0161-04

Abstract [Objective] The aim was to explore the control effect of combined application methods of an oilbased suspension with Trichoderma spp. on bacterial canker of kiwi. [Method] By the processes of liquid fermentation and formulation， a wettable powder （WP） and an oilbased suspension （SC） formulations containing 2×108 individuals/g or 2×108 individuals/mL conidial spores of Trichoderma spp. strain Tr309T were made and used to conduct individual application tests of root drench， spraying and coating or in a combination of spraying + coating （A） or root drench + spraying + coating （B） on controlling the disease of bacterial canker of kiwi. [Result] The disease severity and efficacy rate of disease control in the treatments of root drench， spraying or coating with Tr309TWP or Tr309TSC were all significantly higher or lower， respectively， than those with the treatment of 2% atractylodin + magnolol SC. On the other hand， the disease severity and efficacy rate of disease control in the treatments with combined application of A or B with Tr309TSC or the treatment of 2% atractylodin + magnolol SC were significantly lower or higher， respectively， than those with the treatments of Tr309TWP and pathogen control. [Conclusion] The results provide reference for the biological control of bacterial canker of kiwi.

Key words Bacterial canker of kiwi；Oilbased suspension formulation；Trichoderma spp.；Combined application

獼猴桃细菌性溃疡病是一种由丁香假单胞杆菌-猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae，PSA）侵染，并严重威胁猕猴桃生产和发展的毁灭性病害。该病害具有致病性强、传播快、发生范围广、防治难度大等特点，在短期内可造成大面积树体死亡，已被国家列为中国森林植物检疫性病害[1]。1980年该病首次在美国加利福尼亚州和日本的神州静冈县发现[2]。方炎祖等[3] 于1985年在湖南省东山峰农场的猕猴桃果园中首次发现了该病，当年的发病面积就从一个点扩展到13 hm2。该病菌主要通过风、雨、昆虫、农具等媒介进行传播。雨水充足易使PSA菌量增加，降水量与病害的流行程度有显著相关性[4-5]。

目前，生产上对猕猴桃溃疡病的防治主要通过农田管理和化学农药。李泉厂等[6]研究表明，使用72%农用链霉素和46%可杀得，对发病初期的猕猴桃植株有一定的防治作用，但对进入发病盛期植株的防治效果不明显。由于病原菌对多种化学农药的抗药性日益加重，导致农用链霉素对该病害的防治效果愈来愈差。目前市面上还未出现一种能有效防治猕猴桃溃疡病的化学药剂[7]。冯华等[8]研究指出，通过高效、低毒农药的交替使用，配合多元组合施药方式，可提高防治效果。高蓬明等[9]采用喷雾+涂抹+刮除病斑相结合方法，用72%硫酸链霉素等20种杀菌剂对猕猴桃溃疡病进行室内生测和田间试验，为有效防治猕猴桃溃疡病提供了依据。张锋等[10]采用枝干注射、喷雾、涂抹、灌根等不同组合施药方法进行试验，结果显示，喷雾+刮除病斑+涂抹组合的防治效果可达96%。

近年来，许多科研人员尝试用生防菌对猕猴桃溃疡病进行防治[11-12]。邵宝林等[13]在猕猴桃根部分离得到一株芽孢杆菌B2，用稀释50倍的发酵液喷雾，对该病的防效可达86.52%。盛存波等[12]用芽孢杆菌B56-3的100倍发酵稀释液喷雾，对溃疡病的防效在86.5%～91.4%。申哲等[14]利用放线菌gCLA4的发酵液粗提物稀释100倍对猕猴桃溃疡病的防效达64.9%。谢俊等[15]在开发防治猕猴桃溃疡病的木霉菌生物农药剂型时发现，与可湿性粉剂相比，油悬浮剂具有渗透性和黏附性强、抗蒸发、耐雨水冲刷、增效等优点。笔者利用2种木霉菌制剂，对猕猴桃溃疡病进行大田组合施药防治试验，旨在为生物防治猕猴桃溃疡病，特别在剂型和使用方法的选择上提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 木霉菌株。Tr14（T.asperellum）、Tr25（T.koningiopsis）、Tr34（T.virens）、Tr309T（T.viride）、Tr121（T.harzianum）、Tr64（T.atroviride）均由上海万力华生物科技有限公司提供。

1.1.2 病原菌。Pseudomonas syringae pv.actinidiae（PSA）和猕猴桃树苗（红阳）均由佳沃（成都）现代农业有限公司提供。

1.1.3 培养基。营养肉汤培养基（NB）；

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水 1 000 mL。

1.1.4 供试药剂。

Tr309T-WP和Tr309T-SC均为上海万力华生物科技有限公司产品；

2%溃腐灵SC为潍坊奥丰作物病毒防治有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌株与病原菌（PSA）平板拮抗筛选试验。

1.2.1.1 木霉菌株分生孢子液的制备。用无菌接种铲刮取在PDA平板上培养了5 d（28 ℃）的各木霉菌株的分生孢子并转至含10 mL无菌水的试管中，用血球计数板计数后，用无菌水将分生孢子稀释至2×108个/mL备用。

1.2.1.2 PSA菌液的制备。用接种针将保存于试管斜面上的PSA在无菌条件下接种至装有100 mL NB培养基的500 mL三角瓶中，置于18 ℃、180 r/min摇床上培养48 h。吸取1 mL PSA菌液至装有9 mL无菌水的试管中，用Petrroff-Hauser计菌板计数，用无菌水将PSA菌液含菌量稀释至2×109个/mL备用。

1.2.1.3 木霉菌分生孢子与PSA混合菌液的制备。用移液枪分别吸取木霉菌分生孢子液（2×108 个/mL）和PSA菌液（2×109个/mL）各0.5 mL，加入含9 mL无菌水的试管中，在振荡器上摇匀后，取1 mL菌液，按梯度稀释至 1×10-8个/mL；分别从1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8个/mL梯度试管中各取0.2 mL菌液至PDA平板上，均匀涂布，每组3个重复。以单个病原菌和木霉菌株作为空白对照。在18 ℃下培养5 d后，分别进行观察和统计。

1.2.2 田间药效试验。

1.2.2.1 施药方法。

试验地点为上海浦东孙桥卉绿农场，猕猴桃（红阳）树龄为2～3年。

施药方法：①喷雾施药。均匀喷雾在叶片正反面及枝干上，间隔7 d施药1次，共施药3次，用药量为500 mL/株。②病斑涂抹施药。先将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取稀释液对发病部位进行涂抹，以蘸取无菌水涂抹作对照。每处理涂抹50个病斑，间隔7 d施药1次，共施药3次。③灌根施药。首先灌清水测算出每株猕猴桃用水量，以保证植物根系土壤湿润为准，用药量为1 L/株，间隔7 d施药1次，共施药3次。

挑选长势均一的猕猴桃植株，每个处理10株，3次重复，随机排列。采用针刺接种法[16]对猕猴桃树苗进行病原菌接种，接种后用保鲜膜缠绕接种处保湿48 h，后续采用常规田间管理。

1.2.2.2 单项施药试验设计。

单项施药试验于2015年10—11月进行。喷雾和灌根施药为一组试验，涂抹施藥为独立的试验。每个试验有8个处理：①Tr309T-WP 125倍；②Tr309T-WP 250倍；③Tr309T-WP 500倍；④Tr309T-SC 125倍；⑤Tr309T-SC 250倍；⑥Tr309T-SC 500倍；⑦2% 溃腐灵SC 100倍；⑧病原对照。

1.2.2.3 组合施药试验设计。

组合施药试验共有7个处理：①Tr309T-WP 250倍喷雾+涂抹；②Tr309T-WP 250倍喷雾+涂抹+灌根；③Tr309T-SC 250倍喷雾+涂抹；④Tr309T-SC 250倍喷雾+涂抹+灌根；⑤2%溃腐灵SC 100倍喷雾+涂抹；⑥2% 溃腐灵SC 100倍喷雾+涂抹+灌根；⑦病原对照。

试验在2016年3月 4日第1次施药，后续施药间隔为7 d，共施药3次；第2年开始用药时间为2017年3月22日，施药方法与单项施药一致。

1.2.2.4 调查方法。

①喷雾施药。分别调查第1次施药前及末次用药后7 d的发病情况，记录发病株数和病情指数（DS），统计发病率及防治效果（ERDC）。

②病斑涂抹施药。于施药前挂牌标记病斑，末次施药后7 d调查复发病斑数，计算病斑治愈率。③灌根施药调查方法与喷雾防治试验相同。

④组合施药。调查末次药后7 d的发病情况，调查方法与单项施药相同，记录DS，计算ERDC。

⑤病害分级标准见表 1。

2 结果与分析

2.1 木霉菌株与PSA平板拮抗筛选结果

由表2可知，各木霉菌株以及PSA均能在PDA上生长良好，并在5 d内覆盖整个平板。在混合涂布的平板上，Tr14、Tr25、Tr34、Tr64、Tr121分别只在稀释浓度为1×10-5个/mL的平板上抑制了PSA的生长，而在稀释浓度为1×10-6、1×10-7、1×10-8个/mL的平板上，PSA则抑制了这些木霉菌株的生长。只有 Tr309T 在稀释浓度为1×10-8～1×10-5个/mL的所有平板均抑制了PSA的生长。因此，选择Tr309T，将其制成可湿性粉剂与悬浮剂，继续在大田进行施药方法和剂型的药效试验。

2.2 单项施药试验结果

结果显示（表3、4），喷雾和灌根2种施药方式下，经Tr319-WP 和 Tr319-SC处理的猕猴桃植株的ERCD均随着施药量的增加而提高，但均显著低于2% 溃腐灵SC化学药剂处理。在涂抹施药方式下，经Tr319-WP 和 Tr319-SC处理的猕猴桃植株的RRDS均随着施药量的增加而提高，但均显著低于2%溃腐灵SC化学药剂处理。

2.3 组合施药试验结果

2年组合施药试验结果（表5）表明，在组合施药A方式下，Tr309T-WP、Tr309T-SC、2%溃腐灵处理的DS显著低于病原对照处理（2016年：72.84；2017年：80.03）；在组合施药B方式下，Tr309T-WP和2%溃腐灵SC处理的DS或ERCD都显著高于或低于Tr309T-SC处理。

3 结论与讨论

针对猕猴桃溃疡病的防治，田间管理和化学药剂防治是果农目前采用的主要手段[16]。较为有效的化学药剂有2类，分别是含铜制剂和农用链霉素类。秦虎强等[17]利用72%农用链霉素SPX和4%氢氧化铜WG对猕猴桃溃疡病进行防治，防效分别达76.6%和73.4%。龙友华等[18]发现40%硫酸链霉素50倍稀释液对溃疡病的田间防效在78.7%以上。然而，含铜制剂常常会对猕猴桃叶片造成药害，而且长期使用链霉素会使病原菌对其产生抗药性[19]。该研究结果显示，利用木霉菌制剂对该病害进行防治，不仅在防治效果上与化药相似，同时不会对植物造成药害，也不会对环境造成污染。谢俊等[15]在开发防治猕猴桃溃疡病的木霉菌生物制剂时发现，与可湿性粉剂相比，油悬浮剂具有渗透性和黏附性强、抗蒸发、耐雨水冲刷、增效等优点。罗秀[20]在防治稻纵卷叶螟研究中发现，白僵菌可分散油悬浮剂对卷叶螟的防治效果明显优于苏云金杆菌可湿性粉剂。该研究采用的组合施药对比试验有相似的结果。经木霉菌Tr309T-SC组合施药A或B 处理的猕猴桃植株，在防治效果上都分别好于经木霉菌Tr309T-WP处理的植株。说明油悬浮剂能使木霉菌更好地附着在猕猴桃植株上，不易被雨水冲刷，有助于木霉菌在猕猴桃地上部分发挥药效。

张锋等[10]在防治猕猴桃溃疡病的组合施药技术上采用了喷雾+涂抹、喷雾+灌根、灌根+涂抹，并发现喷雾+涂抹组合的防治效果最佳。该研究在喷雾+涂抹组合的基础上，增加了灌根处理（组合施药B），显著地提高了对猕猴桃溃疡病的防治效果。孙虎等[21]、邱德文[22]研究发现，灌根能将木霉菌接种至作物根部，使其在根际土壤中定殖并改善根际土壤环境，增强作物长势，并诱导作物对多种病害产生系统抗性。Viterbo等[23]通过灌根，将绿色木霉菌接种到黄瓜幼苗根部，使黄瓜对细菌性角斑病产生系统抗性。

为加速绿色农业的可持续发展，环境友好型的生物农药越来越受到青睐。许多学者已对利用EM菌[24]、芽孢杆菌[11]和放线菌[14]等防治猕猴桃溃疡病进行了多方面的研究。但利用生防真菌防治猕猴桃溃疡病的研究还鲜有报道。该研究通过对木霉菌株的筛选，对合适的剂型以及施用方法进行了多项测试，为有效防治猕猴桃溃疡病提供了依据。

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