春兰SRAP—PCR反应体系的建立与优化

袁媛　孙叶　李风童　包建忠　陈秀兰

摘要 [目的]构建适合春兰SRAP-PCR反应的最佳体系。[方法]对影响PCR反应的5个变量（dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶量、模板DNA用量）采用L16（45）正交试验设计，建立春兰SRAP-PCR最适反应体系。[结果]最佳优化体系为0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA，共20 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min，反应前5个循环在94 ℃变性1 min、35 ℃复性1 min、72 ℃延伸1 min的条件下运行，随后的30个循环复性温度提高至50 ℃，最后72 ℃延伸10 min。[结论]该体系有利于SRAP分子標记在春兰材料上的应用，为春兰分子遗传育种奠定了基础。

关键词 春兰；SRAP-PCR；正交试验设计；体系优化

中图分类号 S682.31 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0105-03

Abstract [Objective]To establish the suitable SRAPPCR reaction system for Cymbidium goeringii .[Method] L16（45） of orthogonal design was used to optimize SRAPPCR of C. goeringii in 5 factors such as dNTPs concentration， Mg2+ concentration， primer concentration， Taq DNA polymerase amount and DNA template amount. [Result]The optimized system was as follows： a total volume of 20 μL including 0.25 mmol/L dNTPs， 2.50 mmol/L Mg2+， 0.80 μmol/L primer， 1.00 U Taq DNA polymerase， 200.00 ng DNA template. The suitable SRAPPCR procedure was 4 min of denaturing at 94 ℃， five cycles of three steps， 1 min of denaturing at 94 ℃， 1 min of annealing at 35 ℃ and 1 min of elongation at 72 ℃， in the following 30 cycles， the annealing temperature was increased to 50 ℃， with a final elongation step of 10 min at 72 ℃. [Conclusion]The SRAPPCR reaction system for SRAP markers of C. goeringii could be applied in C. goeringii molecular genetics research.

Key words Cymbidium goeringii；SRAPPCR；Orthogonal experiment design；Optimization of reaction system

兰科（Orchidaceae）是开花植物中最大科之一，拥有25 000多个种[1]。春兰（Cymbidium geringii）属于兰科兰属多年生草本植物，其花幽香，叶姿秀美，具有较高的观赏价值和经济价值。长期的自然杂交和人工选育使得各变种及自然杂交种不断出现，传统的鉴定方法已不能较为系统地鉴定春兰品种间的亲缘关系。仅凭叶色、叶型、花色、花型和花梗等传统形态指标来辨识品种存在很大难度，也影响新品种的注册登录和产权保护[2]。因此，利用分子标记技术研究春兰分类及种质资源遗传多样性评价就显得相当必要。

序列相关扩增多态性标记（sequence related amplified olymorphism，SRAP）是Li和Quiros发展的一种新的分子标记技术[3]，具有简便、快捷、稳定、高效、共显性高及在基因组中分布均匀等特点。它针对基因外显子富含GC而启动子和内含子富含AT的特点来设计引物进行扩增，因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性[4]。目前该技术已成功应用于对水稻[5]、小麦[6]、甜瓜[7]、野牛草[8]、辣椒[9]、棉花[10]等植物的研究中。该研究采用正交试验设计，对影响春兰SRAP-PCR反应体系的dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量这5个因素进行优化试验，旨在建立适用于春兰的SRAP-PCR反应体系，为今后进一步利用SRAP分子标记开展兰花种质资源鉴定和遗传图谱构建等研究工作打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以江苏里下河地区农业科学研究所花圃中的春兰嫩叶为试材，取样后-20 ℃保存备用。根据前期试验，引物Me1/Em7（Me1：5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′，Em7：5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′）对春兰具有良好的条带可读性和多态性，故选其为此次正交试验的固定引物。

1.2 DNA提取和质量检测

采用改良的CTAB法提取基因组DNA[11]，溶解于TE溶液。DNA的浓度和纯度测定使用OneDrop1000超微量分光光度计，选用OD260/OD280在1.7～1.9的DNA，将DNA稀释至所需的浓度（50 ng/μL），-20 ℃储存备用。

1.3 PCR反应体系正交设计

选用L16（45）正交设计表，对影响PCR反应体系的5个主要因素（dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量）在4个水平上进行试验，PCR反应因素水平见表1，L16（45）设计方案见表2。SRAP-PCR反应体系共20 μL，包括5个因素的不同水平，每个体系添加2.00 μL的10×Buffer，加ddH2O至终体积。正交设计共16个处理，每个处理3次重复。

1.4 SRAP-PCR的扩增及检测

SRAP-PCR扩增反应在Agilent Sure Cycler 8800 PCR仪中进行。扩增程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR產物用2%琼脂糖（含溴化乙锭）电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，90 V稳压1 h，于凝胶成像仪上观察并照相记录。

1.5 最佳反应体系的检测

选取Me1/Em7和Me11/Em8（Me11：5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′，Em8：5′- GACTGCGTACGAATTCA-3′）对16份春兰材料进行PCR扩增，经2%琼脂糖凝胶电泳并染色后，在紫外成像系统上拍照检测，来验证反应体系的稳定性和可行性。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

采用不同的反应体系，春兰基因组DNA的SRAP-PCR扩增电泳图谱见图1。从图1可以看出，不同dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶量和模板DNA用量的16个反应体系，扩增结果存在明显差异。第1、5、9、13和14号反应体系无扩增；第6、15、16号反应体系扩增条带模糊，弥散严重；第2、3、4、7、8和10号反应体系扩增条带中有1条较亮，其他条带较弱且模糊不清晰；第11号反应体系扩增条带较多，强弱均匀且清晰可辨，是比较理想的扩增模式。综上所述，选定第11号反应体系（含0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA）作为春兰基因组DNA的SRAP-PCR反应体系。

2.2 优化的反应体系稳定性

应用该最佳反应体系，利用引物Me1/Em7和Me11/Em8 对16份春兰材料进行SRAP-PCR扩增，得到清晰、多态性高的SRAP谱带（图2），且具有较好的稳定性。说明该体系较稳定，适用于春兰SRAP-PCR反应。

3 讨论

SRAP是一种基于PCR的新型分子标记，最早是在芸薹属作物中开发出来的，现已成功应用在多种作物的种质资源鉴定、遗传图谱构建、比较基因组学研究等方面[12]。SRAP标记正向引物可特异结合开放阅读框（ORF）区域中的外显子，反向引物可特异结合启动子和内含子区域，由于不同个体及物种内含子、启动子间间隔长度不同而产生多态性[13]。SRAP比RAPD重复性、稳定性好，与AFLP相比，操作简便、成本更低，相比SSR标记开发简单[14]，但同样受到反应条件和扩增程序变化的影响，因此有必要对春兰基因组DNA的SRAP-PCR反应条件进行优化。

笔者采用正交试验方法，建立了春兰SRAP-PCR的反应体系：0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA，共20 μL。同时，利用2对引物对16份春兰材料进行扩增，检验了该SRAP-PCR反应体系的稳定性。春兰SRAP-PCR优化体系的建立为以后应用SRAP分子标记研究兰花资源及其他近缘种的遗传多样性提供了参考。

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