四倍体马铃薯“合作88”PVY、PLRV抗性基因的基因型分析

罗杰　唐唯　王培　唐飞　李灿辉

摘要 [目的]分析四倍体马铃薯“合作88”PVY、PLRV抗性基因的基因型。[方法]利用969个自交分离群体株系，采用田间性状调查、DAS-ELISA病毒检测、抗性基因连锁分子标记检测。[结果]田间调查PVY、PLRV抗病与感病的比为968.000∶1和41.130∶1，推测基因型分别为YYYy和RRrr，分离方式为染色单体随机分离和染色体随机分离；DAS-ELISA检测PVY、PLRV阴性与阳性的比为483.500∶1和19.617∶1，推测基因型分别为YYYy和RRrr，分离方式均为完全均衡式分离；分子标记RYSC3检测PVY抗性基因Ryadg有特异性和无特异性的比为322.000∶1，推测PVY基因型为YYYy，分离方式为完全均衡式分离；分子标记DMB32-11检测PLRV抗性基因Rlretb有特异性和无特异性的比为32.414∶1，推测PLRV基因型为RRrr，分离方式为染色体随机分离。[结论]3种试验方法均表明四倍体马铃薯“合作88”PVY抗性基因的基因型是YYYy，PLRV抗性基因的基因型是RRrr，二者在遗传分离时存在多种分离方式。

关键词 马铃薯；PVY；PLRV；抗性基因；基因型

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0098-04

Abstract [Objective] To analyze the genotype of PVY and PLRV resistance genes in tetraploid potato ‘Cooperation88. [Method] In this study， field investigation， DASELISA assays and resistance gene linked molecular marker detection were used to analyze 969 selfinbred lines. [Result] In field investigation， the ratios of PVY and PLRV resistance and susceptibility plants were 968.000∶1 and 41.130∶1， respectively. It was speculated that the resistance genotypes of PVY and PLRV were YYYy and RRrr， and the corresponding separation ways were chromatids random separation and chromosomes random separation. The DASELISA detection results showed that the PVY and PLRV infection ratios between negative and positive were 483.500∶1 and 19.617∶1. The deduced resistance genotypes of PVY and PLRV were YYYy and RRrr and they all run the complete equilibrium segregation way. The PVY resistance gene， Ryadg， had a genotype of YYYy and a ratio of 322.000 existence to 1 deficiency in self inbred lines according to the detection of PVY linked molecular marker RYSC3， segregated in a complete equilibrium segregation way. Meanwhile， PLRY linked molecular marker DMB3211 was used to check the ratio between the existence or deficiency of PLRV resistance gene Rlretb. The ratio was 32.414∶ 1. The result showed Rlretb may has a genotype of RRrr with the way of random chromosome segregation. [Conclusion] Three methods were used to investigate genotypes of PVY and PLRV resistance genes in potato cultivar ‘Cooperation 88. Each method can deduce to the same genotypes of PVY and PLRV （YYYy and RRrr）， and two potato virus genes shared several segregation ways during genetic reproduction.

Key words Potato；PVY；PLRV；Resistance genes；Genotype

馬铃薯（Solanum tuberosum L.）属茄科，原产于智利和安第斯山区，是全球四大粮食作物之一，从2005年起发展中国家的马铃薯生产就占全球主体地位[1-2]。马铃薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）和马铃薯卷叶病毒（Potato Leafroll Virus，PLRV）主要依靠蚜虫传播，PLRV也可以依靠摩擦传播，由它们引起的马铃薯病害的危害程度仅次于晚疫病[3]。马铃薯被PVY和PLRV侵染后会导致其产量、品质和商品性下降并且种质资源衰减严重[4]。因此，马铃薯的抗病性便成为目前新品种选育的主要关注点之一。

四倍体马铃薯“合作88（Cooperation-88，简称C88）”是云南师范大学、会泽县农技推广中心和国际马铃薯中心合作选育的抗病害较高的马铃薯品种，具有马铃薯野生种S.andigena、S.demissum和普通栽培种S.tuberosum遗传背景，基因组可能为异源四倍体[5]。C88为西南地区主栽品种，其抗病害研究对西南地区马铃薯的经济发展起了至关重要的作用。据云南省马铃薯品种区域试验表明，C88对PVY、PLRV具有抗性，但基因型并不清楚，相关研究报道较少[6]。PVY、PLRV为单基因控制，但PLRV抗性相关基因的表达存在修饰基因和环境的影响，同源四倍体单基因存在染色体随机分离、染色单体随机分离和完全均衡式分离3种分离方式[7-11]。笔者选用C88自交分离群体即自交一代相当于F2代，进行田间性状调查、DAS-ELISA检测及抗性基因紧密连锁的分子标记相结合的方法来分析亲本C88的PVY、PLRV抗性基因的基因型及遗传分离方式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料。四倍体马铃薯C88自交分离群体1 111个株系及亲本C88（CK）。脱毒块茎播种，时间：2017年3月18日，地点：云南师范大学马铃薯试验育种基地大田。调查期间不施任何药物杀虫、杀菌。

1.1.2 主要试剂。DAS-ELISA试剂盒，由美国Agdia生产。

1.1.3 主要仪器。GF-M3000型号酶标仪，由山东高密彩虹分析仪器有限公司生产；9700型号电泳仪，由中国北京六一公司生产；5418型高速离心机，由德国Eppendorf公司生产；4200型凝胶成像系统，由上海天能公司生产。

1.2 方法

1.2.1 田间性状调查。PVY、PLRV性状统计标准见表1[12]。为了更准确地分析C88抗性水平的表型并且排除复合感染或其他病毒侵染表现出的类似症状等，只将等级为3级及以上的株系作为发病处理。在现蕾期和开花期之间记载，调查共分3次进行，分别为2017年5月18日、6月2日、6月22日，取各等级下的发病株数平均值作为性状调查记录。

1.2.2 DAS-ELISA检测。按试剂盒说明书进行PVY、PLRV的检测。提取液：带皮块茎1 g加10 mL裂解液（美国Agdia）研磨；显色时间：以23 ℃显色1 h的OD值进行判定；结果判定：在405 nm波长下检測，样品显黄色且OD值为阴性OD值的2倍及以上判定为阳性，即样品侵染上了病毒。阳性、阴性对照均来自美国Agdia公司提供的标准品。

1.2.3 DNA制备。摘取新鲜幼嫩叶片，采用改良CTAB法经液氮研磨提取总DNA，于-20 ℃保存备用[13]。

1.2.4 分子标记检测。引物相关信息见表2[14-15]，扩增产物经浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应体系为25 μL，1×PCR Mastermix（北京擎科新生物有限公司生产）22 μL，引物各1 μL（10 μmol/L，北京擎科新生物有限公司合成），模板DNA 1 μL（50 ng）。PCR扩增条件为98 ℃预变性2 min；35个PCR循环（98 ℃变性10 s，退火10 s，72 ℃延伸10 s），72 ℃总延伸1 min。

2 结果与分析

2.1 性状调查、DAS-ELISA检测、分子标记结果分析

2.1.1 性状调查。共种植1 111个株系，97个株系未出苗，35个株系在统计期间死亡，3次调查均统计的共969个株系，后续分析均用以上969个株系。田间调查结果表明：被PVY侵染的植株在叶背出现典型的叶脉坏死症状（图1A）；被PLRV侵染的植株其叶片卷曲成匙状或筒状（图1B）；没被PVY或PLRV侵染的植株无任何症状（图1C）。统计结果见表3。

2.1.2 DAS-ELISA检测结果。按照试剂盒说明书对969个株系带皮块茎进行了PVY、PLRV检测，微孔板显色结果表明：阳性对照为黄色，阴性对照为无色，空白对照为无色，各OD值见图3。直接观察显色和酶标仪读数表明：对照C88均没有被PVY、PLRV侵染；969个株系中，2个株系被PVY侵染，47个株系被PLRV侵染。

2.1.3 DNA质量检测结果。对969个样品提取DNA后经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（图4），表明DNA电泳条带清晰，无拖尾、弥散，微量紫外分光光度仪测定OD260/OD280为1.7～1.8，可满足后续试验要求。

2.1.4 PCR扩增结果。标记RYSC3检测的969个株系中，没有扩增出条带的有3个株系，即C88-11、C88-792和C88-1274；标记DMB32-11检测的所有株系中，没有扩增出条带的有29个株系，即株系C88-174、C88-190、C88-202、C88-208、C88-329、C88-330、C88-331、C88-463、C88-464、C88-465、C88-466、C88-620、C88-625、C88-652、C88-653、C88-684、C88-710、C88-725、C88-726、C88-734、C88-746、C88-749、C88-765、C88-1112、C88-1286、C88-1360、C88-1364、C88-1369。分子标记扩增的琼脂糖凝胶电泳示意图分别见图5、6。

2.2 C88对PVY、PLRV抗性基因的基因型分析

C88性状统计、DAS-ELISA和分子标记检测结果表明，C88对PVY和PLRV具有较高抗性，PVY抗性基因的基因型可能为YYYy（Y为显性基因，y为隐性基因）或YYyy，PLRV抗性基因的基因型可能为RRRr（R为显性基因，r为隐性基因）或RRrr。田间性状统计、DAS-ELISA及分子标记分析得到PVY、PLRV抗性基因的基因型和分离方式汇总结果见表3。

单基因座上同源四倍体自交和遗传的理论分离情况为：①亲代基因型是AAAa时，处于染色体随机分离、染色单体随机分离、完全均衡式分离下的后代分离比分别为1.000∶0、783.000∶1、575.000∶1；②亲代基因型是AAaa时，分别为35.000∶1、20.778∶1、19.250∶1；③亲代基因型是Aaaa时，分别为3.000∶1、2.484∶1、2.408∶1[9-11]。

性状调查分析发现：①PVY抗病与感病的比968.000∶1，与理论值783.000∶1最接近，因此推测PVY的基因型为YYYy，分离方式为染色单体随机分离；②PLRV抗病与感病的比为41.130∶1，与理论值35.000∶1最接近，因此推测PLRV的基因型为RRrr，分离方式为染色体随机分离。

DAS-ELISA检测结果分析发现：①PVY检测结果的阴性与阳性比为483.500∶1，与理论值575.000∶1最接近，因此推测PVY的基因型为YYYy，分离方式为完全均衡式分离；②PLRV检测结果的阴性与阳性的比为19.617∶1，与理论值19.250∶1最接近，因此推测PLRV的基因型为RRrr，分离方式为完全均衡式分离。虽然DAS-ELISA是检测植株是否携带病毒及病毒含量，与抗性基因的基因型没有直接关系，但该结果也能间接反映出抗性基因与病毒互作间的对应关系。

分子标记检测结果分析发现：①分子标记RYSC3检测PVY抗性基因Ryadg得到的阳性与阴性的比为322.000∶1，与理论值575.000∶1最接近，因此推测PVY的基因型为YYYy，分离方式为完全均衡式分离；②分子标记DMB32-11检测PLRV抗性基因Rlretb得到的阳性与阴性的比为32.414∶1，与理论值35.000∶1最接近，因此推测基因型为RRrr，分离方式为染色体随机分离。

3 结论与讨论

田间性状调查、DAS-ELISA、分子标记的所有结果都表明：四倍体马铃薯“合作88”PVY抗性基因的基因型是YYYy，PLRV抗性基因的基因型是RRrr；亲本C88对PVY、PLRV具有较高的抗性，符合文献报道[6]。

在不施用任何杀虫剂和杀菌剂的情况下，PVY和PLRV在自然条件下理论上应为随机传播。但PVY、PLRV的抗性也可能受环境影响，造成在不同种植季节的调查结果差异较大。该试验材料种植于春季，在调查过程中发现蚜虫较多，且由于分离群体的其他性状均存在分离，如抗晚疫病水平、出苗时间不同等，因此PVY、PLRV在该试验中的性状调查结果并不能完全准确地反映出亲本C88及自交分离群体的抗性水平。为了进一步验证表型结果，笔者对所有材料进行了病毒检测，即DAS-ELISA检测，结果表明性状调查结果较为准确。RYSC3和DMB32-11分别为PVY抗性基因Ryadg和PLRV抗性基因Rlretb紧密连锁的分子标记，所以标记的分离情况可以直接代表目的基因的基因型[14-15]。该研究用3种试验方法推测的分离比和遗传分离方式不一致，表明在实际的减数分离中，由于着丝点与目的基因总存在一定距离，并不会都进行交换，4个等位基因也都是随机配对，所以会存在多种遗传分离方式，这符合Little观点[16]。

四倍体基因组杂合度较高，其基因型研究相对二倍体复杂，目前没有合适的基因型-表型连锁的QTL（Quantitative Trait Locus，数量性状基因座）分析模型。因此该研究利用性状调查、病毒检测和与抗性基因紧密连锁的分子标记相结合的手段来分析四倍体马铃薯C88的PVY、PLRV抗性基因的基因型，结合理论的基因分离情况，得到了PVY和PLRV的基因型。单倍体马铃薯基因组数据已经发表，一些基于简化基因组测序的四倍体作图方法也相继被报道[17-18]。在后续研究中可将马铃薯基因组学用于重要农艺性状的QTL分析，从而为加快四倍体马铃薯育种提供参考依据。

参考文献

[1] 杨帅，闵凡祥，高云飞，等.新世纪中国马铃薯产业发展现状及存在问题[J].中国马铃薯，2014，28（5）：311-316.

[2] 刘洋，高明杰，罗其友，等.世界马铃薯消费基本态势及特点[J].世界农业，2014（5）：119-124.

[3] 王晓月，金黎平，尹江.马铃薯抗病毒病育种研究进展[J].中国马铃薯，2005，19（5）：285-289.

[4] 郭志乾，董凤林.马铃薯病毒性退化与防治技术[J].中国马铃薯，2004，18（1）：48-49.

[5] LI C H，WANG J，CHIEN D H，et al.Cooperation88：A high yielding，multipurpose，late blight resistant cultivar growing in southwest China[J].American journal of potato research，2011，88（2）：190-194.

[6] 李云海，李進学，何云昆，等.云南省马铃薯品种区域试验回顾[J].中国马铃薯，2002，16（2）：108-112.

[7] HMLINEN J H，WATANABE K N，VALKONEN J P T，et al.Mapping and markerassisted selection for a gene for extreme resistance to potato virus Y[J].Theoretical and applied genetics，1997，94（2）：192-197.

[8] MARCZEWSKI W，FLIS B，SYLLER J，et al.A major quantitative trait locus for resistance to potato leafroll virus is located in a resistance hotspot on potato chromosome XI and is tightly linked to Ngenelike markers[J].Molecular plantmicrobe interactions，2001，14（12）：1420-1425.

[9] 余誕年.同源四倍体的自交和遗传平衡[J].遗传学报，1979，6（1）：31-32.

[10] 曲志才.单基因座上各种同源四倍体基因的理论分离比[J].生物学教学，2008，33（12）：57-58.

[11] 陈德鑫，潘重光.关于同源四倍体的基因分离[J].上海农学院学报，1985，3（1）：63-70.

[12] 黄强.影响马铃薯退化的因素分析[D].昆明：云南师范大学，2015.

[13] DOYLE J J，DOYLE J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical bulletin，1987，19：11–15.

[14] KASAI K，MORIKAWA Y，SORRI V A，et al.Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on a common feature of plant disease resistance genes[J].Genome，2000，43（1）：1-8.

[15] KUHL J C，NOVY R G，WHITWORTH J L，et al.Development of molecular markers closely linked to the potato leafroll virus resistance gene，Rlretb，for use in markerassisted selection[J].American journal of potato research，2016，93（3）：203-212.

[16] LITTLE T M.Gene segregation in autotetraploids[J].Botanical review，1945，11（1）：60-85.

[17] HACKETT C A，MCLEAN K，BRYAN G J.Linkage analysis and QTL mapping using SNP dosage data in a tetraploid potato mapping population[J].PLoS One，2013，8（5）：1-21.

[18] JIANG N，ZHANG F J，WU J H，et al.A highly robust and optimized sequencebased approach for genetic polymorphism discovery and genotyping in large plant populations[J].Theor Appl Genet，2016，129：1739-1757.