尿黑酸影响拟南芥酪氨酸降解缺陷突变体sscd1的种子萌发

汤睿　雷雨婷　任春梅

摘要 [目的]探究外源添加尿黑酸对拟南芥酪氨酸降解途径的影响。[方法]以拟南芥野生型和酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1、hgo为材料，通过在培养基中添加不同浓度尿黑酸，分析长、短日照下对种子萌发的影响。[结果]在长、短日照下，外源添加0.1～0.4 mmol/L浓度尿黑酸推迟sscd1突变体种子萌发；外源添加0.8 mmol/L浓度尿黑酸抑制sscd1突变体种子萌发，而该浓度的尿黑酸对野生型和hgo突变体种子萌发没有影响。另外，在培养基中添加酪氨酸降解途径的异常代谢产物——琥珀酰丙酮，在长日照下也能抑制野生型种子萌发。[结论]尿黑酸处理后激活了酪氨酸降解途径，使sscd1突变体中积累较多的琥珀酰丙酮从而影响其种子萌发。

关键词 拟南芥；sscd1突变体；酪氨酸降解途径；尿黑酸；琥珀酰丙酮；种子萌发

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0092-04

Abstract [Objective]To investigate the effects of homogentisate on the tyrosine degradation pathway in Arabidopsis thaliana.[Method]Wildtype and tyrosine pathwaydeficient mutants （sscd1，hgo） of A. thaliana were used as materials to study the effects on seeds germination by adding different concentration of homogentisate under long or short day. [Result]The seeds germination of sscd1 mutant would be delayed by homogentisate with the concentration of 0.1-0.4 mmol/L under long or short day. The germination of sscd1 mutant was inhibited by 0.8 mmol/L homogentisate，while it had no effect on germination of wildtype and hgo mutant. In addition，succinylacetone，an abnormal metabolite of the tyrosine degradation pathway，also inhibited the germination of wildtype seeds under long day.[Conclusion]The tyrosine degradation pathway was activated with the treatment of homogentisate，thereby affecting the germination of the sscd1 mutant with succinylacetone accumulated.

Key words Arabidopsis thaliana；sscd1 mutant；Tyrosine degradation pathway；Homogentisate；Succinylacetone；Seed germination

對动物来说，酪氨酸降解是一条很重要的代谢途径。在动物体内，酪氨酸先由酪氨酸氨基转移酶催化生成对羟基苯丙酮酸，然后被对羟基苯丙酮酸双氧化酶催化生成尿黑酸（homogentisate），再经尿黑酸1，2—双加氧酶（homogentisate dioxygenase，HGO）作用氧化形成马来酰乙酰乙酸（maleyl acetoacetate，MAA），后者经马来酰乙酰乙酸异构酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸（fumaroylacetoacetate，FAA），之后在延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解[1-4]。

植物信号传导实验室前期通过EMS诱导法分离了一种在短日照条件下发生细胞死亡的拟南芥突变体sscd1[5]。这种突变体在短日照条件下的MS培养基上全部萌芽，培养一段时间后叶片会出现先萎蔫后白化的现象。采用台盼蓝染色的方法证实了突变体sscd1萎蔫处发生细胞死亡[6]。通过基因定位和序列分析发现sscd1基因编码酪氨酸降解途径的最后一个酶FAH。酪氨酸降解途径在动物中是必不可少的，FAH缺失会导致动物先天性致死。FAH基因发生突变将导致中间代谢产物MAA、FAA的积累，一旦MAA和FAA在体内积累将会引起异常代谢，并转化为琥珀酰乙酰乙酸（succinylacetoacetate，SAA），并且SAA进一步自发经过非酶促的脱羧反应形成琥珀酰丙酮（succinylacetone，SUAC）[7]。前期研究发现，在植物中，SUAC在短日照下才出现积累，长日照下则不会[8]。然而，酪氨酸降解途径在植物中的作用仍有待阐明。该试验以拟南芥野生型Col-0和酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1、hgo为研究材料，通过外源添加尿黑酸处理的方法来研究长、短日照下Col-0、sscd1和hgo萌发的变化。探究尿黑酸对拟南芥酪氨酸降解途径的影响，并对尿黑酸在植物体内的作用做进一步了解。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Columbia（Col-0，WT）、酪氨酸降解缺陷突变体sscd1和hgo，全部由植物信号传导实验室提供。

1.2 试剂与仪器

尿黑酸（东京化成工业株式会社D1050，1 g，日本）；MS培养基粉（Phyto technology laboratories M519，100 L，美国）；SYBR（Roche 04913914001，100 mL，瑞士）；蔗糖；琼脂粉（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；智能人工气候箱（PRX-450B，赛福）。

1.3 方法

1.3.1 尿黑酸、琥珀酰丙酮母液配制及添加。

称取0.336 g尿黑酸溶于20 mL 30%丙酮溶液中，配制成100 mmol/L母液，抽滤灭菌，置于-20 ℃避光保存。使用时取不同体积尿黑酸母液加入MS培养基中混匀，配制成含不同浓度尿黑酸的MS培养基。

称取0.024 g琥珀酰丙酮溶于100 μL丙酮配制成100 μg/mL母液。使用时取不同体积琥珀酰丙酮母液加入MS培养基中混匀，配制成含不同浓度琥珀酰丙酮的MS培养基。

1.3.2 拟南芥的培养。

1.3.2.1 尿黑酸处理培养。拟南芥种子用消毒液（20%bleach+0.1%Triton 100）处理10～12 min，随后置于超净工作台上将消毒水去除并用无菌水清洗種子3～4次后悬浮于0.1%琼脂溶液中，铺种在含1%蔗糖和不含或分别含有0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L尿黑酸的MS培养基上，放置4 ℃冰箱春化3 d，再置于光周期为长日照（long day，16 h光照，8 h黑暗）和短日照（short day，8 h光照，16 h黑暗）的人工气候箱生长，培养温度设置为（22±2）℃，光照强度设置为80～120 lx，相对湿度设置为65%。

1.3.2.2 琥珀酰丙酮处理培养。拟南芥种子用消毒液（20%bleach+0.1%Triton 100）处理10～12 min，随后置于超净工作台上将消毒水去除并用无菌水清洗种子3～4次后悬浮于0.1%琼脂溶液中，铺种在含1%蔗糖和不含或分别含有60、120、240 μg/mL琥珀酰丙酮（SUAC）的MS培养基上，放置4 ℃下春化3 d，再置于光周期为8 h光照和16 h黑暗的人工气候箱生长，培养温度设置为（22±2）℃，光照强度设置为80～120 lx，相对湿度设置为65%。

1.4 测定方法及指标

选取长、短日照条件下尿黑酸处理的拟南芥材料，分别对野生型、hgo和sscd1突变体材料的萌发情况进行统计。尿黑酸处理后的种子萌发率/未处理野生型的种子萌发率即为种子的相对萌发率，选取经SUAC处理的野生型和sscd1突变体材料，分别对2种材料的萌发情况进行统计，SUAC处理后萌发的种子数/铺种的全部种子数即为种子的萌发率，结果为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 尿黑酸处理影响sscd1突变体的种子萌发

为了进一步研究外源添加尿黑酸对酪氨酸降解途径的影响，对长、短日照条件下生长1、2 d的种子相对萌发率进行统计发现（图1），长日照下生长1 d，野生型、hgo和sscd1突变体在不含尿黑酸情况下相对萌发率差别不大；外源添加尿黑酸对野生型和hgo突变体的相对萌发率也无明显影响，而sscd1突变体的相对萌发率随着尿黑酸浓度的增加显著降低，在0～0.8 mmol/L范围内相对萌发率分别为100%、75.5%、67.2%、59.7%和27.0%（图1A）。短日照萌发情况与长日照类似，外源添加尿黑酸对野生型和hgo突变体的相对萌发率影响不大，sscd1突变体的相对萌发率同样随着尿黑酸浓度增加而逐渐降低（图1B）。无论长日照还是短日照，生长2 d时，sscd1突变体相对萌发率都有明显上升（图1C、1D）。

长、短日照1 d，尿黑酸对sscd1突变体萌发有明显抑制作用，其中长日照对萌发的抑制效果比短日照更明显（图1A、1B）。生长2 d，尿黑酸对sscd1突变体萌发的抑制作用明显减弱：在0～0.4 mmol/L浓度范围内，对sscd1突变体萌发抑制减弱，甚至在0.1、0.2 mmol/L 浓度下相对萌发率恢复到与野生型和hgo突变体一致；浓度为0.4 mmol/L时仍存在抑制作用，但是短日照比长日照抑制更明显；当浓度增加至0.8 mmol/L后，长、短日照下萌发率基本一致（图1C、1D）。生长2 d，未萌发种子不再萌发，长、短日照培养5 d后，野生型和hgo突变体基本萌发，而sscd1突变体有大部分未萌发（图2）。这表明低浓度尿黑酸延迟拟南芥种子萌发，高浓度

2.2 琥珀酰丙酮（SUAC）处理影响野生型拟南芥的种子萌发

前期研究发现sscd1突变体在短日照下积累SUAC，该物质是FAH功能失活后酪氨酸降解异常产生的代谢产物。为了探究作为中间代谢产物的SUAC对拟南芥种子萌发的影响，对长日照条件下SUAC处理的种子萌发率进行统计后发现（图3）：未添加SUAC生长1 d（LD-1）时萌发率最高为85.5%；添加60 μg/mL SUAC后萌发率为71.0%；添加120 μg/mL SUAC后萌发率为68.5%；添加240 μg/mL SUAC后萌发率为57.5%。生长3 d时，不同浓度SUAC处理的野生型材料萌发率都呈现上升趋势，不含或分别含有60、120和240 μg/mL SUAC的萌发率分别为100%、80.5%、75.0%、65.0%。继续长日照培养8 d后发现，不含SUAC处理的培养基中，野生型正常生长（图4A）；SUAC含量达60、120 μg/mL时，种子萌发和幼苗生长都开始受到抑制（图4B、4C），且SUAC含量达120 μg/mL后，幼苗叶片开始出现白化死亡表型（图4C）；随着SUAC含量的继续上升，种子萌发和幼苗生长受到强烈抑制（图4D）。这表明，添加SUAC处理抑制了野生型种子的萌发，且随着浓度升高抑制明显，未接受处理则不受影响。

3 讨论

尿黑酸作为酪氨酸降解途径的一个重要中间代谢产物，它对酪氨酸降解途径正常代谢起着至关重要的作用。前期研究发现，引起死亡的原因是酪氨酸降解途径的中断，导致中间代谢产物MAA和FAA的积累，这些代谢产物将会毒害动物的细胞和组织，最终引起动物死亡[9-10]。当FAH基因失活，将导致中间代谢产物MAA、FAA的积累，并引起代谢异常，MAA和FAA转化为SAA，接着SAA经过自发的非酶促脱羧反应形成SUAC[7]。SUAC对生物细胞有毒害作用，SUAC在体内积累会导致细胞死亡[11]。编码酪氨酸降解途径第三步酶HGO的基因发生突变后能阻断中间代谢产物MAA和SAA的产生，所以在hgo突变体中不会产生SUAC。通过外源添加SUAC试验，发现一定浓度SUAC能够加速sscd1突变体细胞死亡，而这种细胞死亡是因为中间代谢产物SUAC积累所引起[8]。在该研究中，长、短日照条件下sscd1突变体的种子萌发均受到了明显抑制，说明添加尿黑酸促进了酪氨酸降解，使sscd1突变体中酪氨酸降解途径异常代谢产物SUAC的积累增多，从而抑制种子萌发。一定浓度的尿黑酸处理野生型和hgo突变体，对幼苗萌发没有明显的影响，这是因为在野生型中酪氨酸降解途径是完整的，它自身能够对一定量多余的中间代谢产物进行代谢；而在hgo突变体中，HGO的缺失虽然不能将尿黑酸通过酪氨酸降解途径分解代谢，但尿黑酸可能走其他的代谢途径，比如维生素E合成途径[12]。长、短日照下添加0.1～0.4 mmol/L尿黑酸对sscd1突变体种子萌发有延缓作用，而添加0.8 mmol/L尿黑酸对sscd1突变体种子萌发有抑制作用。这是因为外源添加尿黑酸，促进了酪氨酸代谢途径的中间代谢产物积累（MAA、FAA、SAA和SUAC），未萌发时不能代谢過量的中间代谢产物，从而抑制了种子萌发；由于尿黑酸本身就具有一定的毒性，在动物体中如果尿黑酸过量，严重时会患上尿黑症[13]。在培养时也发现了类似情况，当外源添加尿黑酸浓度过高时，拟南芥种皮颜色会变为黑褐色，且sscd1突变体幼苗子叶也会褐化。这一结果与外源添加SUAC结果一致[8]。为了验证以上结果，进行了外源添加SUAC试验。拟南芥野生型体内酪氨酸降解途径是正常的，外源添加SUAC后，发现添加SUAC抑制了种子萌发，随着浓度的增加，抑制作用越强。说明SUAC能够抑制种子萌发，在酪氨酸降解途径正常情况下，植物自身能够代谢少量的SUAC，从而在培养几天后种子萌发能得到恢复，但超过植物自身代谢量后，会造成毒害作用且抑制种子萌发和细胞发生死亡。该结果也进一步证明了酪氨酸降解途径异常代谢产物SUAC的积累过多，抑制了sscd1突变体种子的萌发。

4 结论

利用生理分析的方法，发现尿黑酸处理能激活酪氨酸降

解途径，加速植物体内酪氨酸降解途径，使sscd1突变体中

SUAC的积累增多，从而抑制sscd1突变体种子的萌发。

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