拟南芥SSP1基因GFP载体构建及GFP植株筛选

吴席 樊婷婷 方雪

摘要 [目的]以野生型拟南芥为材料构建SSP1基因GFP载体及GFP转基因植株。[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA，反转录成为cDNA，并以cDNA为模板，利用高保真酶，进行SSP1基因的克隆，将克隆所获得SSP1基因和pXB94-GFP质粒进行双酶切，利用T4-DNA ligase进行连接，并转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR和测序获得阳性单克隆。通过质粒抽提试剂盒提出构建好的重组质粒，并将其转入农杆菌GV3101中，通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落。将获得的阳性菌通过花序浸染法转入野生型拟南芥中，并通过抗性筛选获得阳性植株。[结果]克隆SSP1基因成功，菌落PCR显示SSP1基因成功连接到pXB94-GFP质粒上并成功转入农杆菌中，抗性筛选获得了SSP1-GFP转基因植株。 [结论]成功获得SSP1-GFP转基因植株，为接下来进一步研究SSP1基因功能奠定了基础。

关键词 拟南芥；SSP1；载体；GFP转基因植株

中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0119-03

Abstract [Objective]To build up the vector of Arabidopsis SSP1GFP and transgenic lines. [Method]Reverse transcription to cDNA by extracting the RNA of wild type Arabidopsis. The CDS fragment of SSP1 gene was amplified by PCR. After treatment with restriction enzymes and T4DNA ligase， the gene was connected to plasmid. Transfer the connection product to DH5α and a positive clone was identified. Then， transfer the recombinant to GV3101. The floraldip method was used to transfer it into wild type Arabidopsis. Finally， we obtained positive plants through resistance screening.[Result]We succeeded in cloning SSP1 gene. The recombinant plasmid was obtained and we got the transgenic lines. [Conclusion]The successful acquisition of SSP1GFP transgenic lines laid the foundation for further research on the function of SSP1 gene.

Key words Arabidopsis；SSP1；Vector；GFP transgenic lines

土壤盐碱化是世界范围内限制农业发展和作物生产的重要因素之一，探索盐胁迫的作用机理以及提高植物抗盐性的途径具有重要的理论和实际意义[1-3]。寻找提高植物抗盐性的关键基因并利用转基因技术对植物品种进行优化改良是解决上述问题的一种行之有效的方法 [4-7]。笔者通过盐胁迫筛选试验发现SSP1基因可以使拟南芥对盐胁迫有所响应。通过克隆SSP1基因，并通过基因工程手段构建SSP1-GFP转基因植株，以进一步探究SSP1基因在拟南芥响应盐胁迫中所起到的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料。

植物材料为拟南芥（Arabidopsis thaliana），购于美国拟南芥种质资源中心，均为哥伦比亚（Columbia，Col）遗传背景，后由合肥工业大学植物分子生物学实验室繁殖所得。

1.1.2 试剂。

TIANprep Mini Plasmid Kit Ⅱ（TIANGEN）、T4-DNA Ligase（NEB）、 PrimeScript RT-PCR Kit （TaKaRa）、限制性内切酶Xho I（NEB）、EcoR I（NEB）、TransStart FastPfu DNA Polymerase ETransGen、壮观霉素、庆大霉素、卡那霉素。

1.1.3 宿主和载体。

大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101，载体pXB94-GFP。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥无菌苗培养。

配制MS固体培养基，从冰箱里取出MS培养基放置至室温，称取所需要的组分放入三角瓶中，加入所需ddH2O，用5 mol/L NaOH溶液调节培养基pH至5.8，用封口膜封好，121 ℃、25 min高温高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至60 ℃左右，将培养基均匀倒入培养皿中，待培养基凝固后即可播种。将消毒后的拟南芥种子于滤纸上晾干，种子晾干以后按试验需要用牙签蘸取点在培养皿上，待一个培养皿播种完成后，用封口膜将培养皿封好；将播种完成后的培养皿倒置于4 ℃冰箱中春化2～3 d，再放入温室中竖直培养14 d。

1.2.2 拟南芥cDNA获取。

提前将研钵清洗干净，然后用锡纸包裹起来，置于180 ℃的烘箱中，高温烘烤足够时间；试验之前要提前将所用试剂如氯仿、无水乙醇、异丙醇等放入-20 ℃冰箱中预冷；称取所需材料100 mg左右，置于研钵中，加入适量液氮进行充分研磨；向研磨破碎后的材料中加入Trizol裂解液1 mL，立即快速研磨直至全部融化；转移研磨完成后的材料到1.5 mL离心管中，于超净台中静置5 min，置于冷冻离心机中4 ℃离心5 min，转速13 000 r/min，小心吸取上清至另一新的1.5 mL EP管中；向1.5 mL EP管中加入200 μL預冷后的氯仿，剧烈振荡15 s，置于超净台静置5 min；利用冷冻离心机4 ℃离心15 min，转速为13 000 r/min，吸取上层水相中的上清液至新的1.5 mL离心管中（切勿吸取到中间层物质，否则会造成DNA污染）；向EP管加入500 μL预冷后的异丙醇，轻轻颠倒混匀，于超净台静置15 min；使用冷冻离心机4 ℃离心15 min，转速为13 000 r/min，小心弃除上清，沉淀即为RNA；使用75%乙醇1 mL清洗沉淀；

冷冻离心机8 000 r/min，4 ℃离心5 min，尽可能弃去上清，于超净台室温干燥10 min，使乙醇挥发干净；向离心管中加入40 μL的RNase-ddH2O溶解，并放入65 ℃的水浴中10 min，使RNA沉淀充分溶解，溶解后吸出少量立即检测其浓度与纯度；检测其浓度与纯度后，根据结果将所得RNA按反转录试剂盒操作反转录成cDNA。

1.2.3 SSP1基因的克隆。

利用Primer 5.0软件设计以下引物进行基因克隆，上游引物FP1：5′-CCGCTCGAGATGGCTGAGGTGGGAAAAG-3′，下游引物RP1：5′-CCGGAATTCTTAGCTTTGGGCAGGCTCTGT-3′，以获得的cDNA为模板进行基因克隆。

1.2.4 酶切、连接及菌落PCR鉴定。

将克隆获得的SSP1基因和pXB94-GFP质粒用限制性内切酶Xho I和EcoR I进行双酶切，并利用T4-DNA Ligase进行连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α，并涂布于含有壮观霉素的LB固体培养基上，于37 ℃倒置培养12 h，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定引物为上游引物F2：5′-TTCGCAAGACCCTTCCTCTA-3′，下游引物RP2：5′-TTAGCTTTGGGCAGGCTCTGT-3′。

1.2.5 花序浸染法获取转基因拟南芥。

将构建成功的重组质粒通过电击转化法转化入农杆菌GV3101中，并通过菌落PCR鉴定阳性单克隆，挑取阳性克隆进行培养，配制浸染液，进行花序浸染，隔7 d，再次进行浸染。将获得的拟南芥种子置于含有卡那霉素的MS固体培养基中进行抗性筛选，获取阳性植株。

2 结果与分析

2.1 拟南芥SSP1基因的克隆

将野生型拟南芥的种子经过消毒以后播种于MS培养基上，并于4 ℃春化 3 d，置于植物培养间培养14 d，用获得的野生型拟南芥提取总RNA，利用反转录试剂盒反转成cDNA。以稀释5倍后的cDNA为模板，通过PCR技术扩增SSP1基因，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，拟南芥网站显示SSP1基因CDS全长为1 392 bp，与电泳结果一致，说明SSP1克隆成功。

2.2 目的片段和质粒双酶切

前期引物设计时，已经在基因克隆上下游引物上分别添加了Xho I和EcoR I的酶切位点，所以使用限制性内切酶Xho I和EcoR I对通过基因克隆获得的SSP1基因和pXB94-GFP质粒同时进行双酶切。酶切以后进行电泳检测获得结果如图2所示。

2.3 连接和大肠杆菌转化后阳性克隆鉴定

将获得的双酶切以后的SSP1基因和pXB94-GFP质粒用T4-DNA Ligase酶进行连接，16 ℃连接16 h，将获得的连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，待长出单克隆以后，挑取单克隆进行PCR验证，菌落PCR鉴定结果如图3所示。PCR条带与目的条带大小一致，说明其为阳性克隆，对阳性克隆进行测序以后，与SSP1CDS序列进行比对，结果完全一致，说明SSP1-GFP重组质粒构建成功。

2.4 农杆菌转化及花序浸染

将SSP1-GFP重组质粒通过电击转化法转化入农杆菌GV3101，待其长出单菌落以后进行菌落PCR验证，电泳结果如图4所示，获得阳性单克隆。将阳性单克隆进行扩培，并通过花序浸染法，对开花期的野生型拟南芥进行转基因。

2.5 SSP1-GFP转基因植株的抗性筛选

获取通过花序浸染法进行转基因后的拟南芥种子，将获得的种子消毒以后播种在含有卡那霉素抗性的MS平板上，置于光照培养箱中培养7～10 d，长出来的小苗（具有根，子叶颜色嫩绿）就是转基因阳性植株，如图5所示，将转基因阳性植株移至土壤中置于温室中进行培养，待植株果荚成熟以后，单株收取种子，进行后续试验。

3 讨论

盐胁迫是自然界中主要的几种非生物胁迫之一，其对农作物产量有极大的影响，且对生态环境的稳定造成威胁。迄今为止，全球范围内约有盐碱化土地950万hm2，我国的盐碱化土地面积约为270万hm2 [8]。一旦土壤中的可溶性盐超标，就会对生长在其上的大部分植物造成伤害。盐胁迫包括渗透胁迫和离子胁迫以及由此引起的次级胁迫如氧化胁迫等，这一系列的影响可能会造成植物生長滞缓，甚至死亡[9-18]。

利用转基因技术对植物品种进行优化改良是应对植物盐胁迫的一个重要方法[19-21]，因此应致力于寻找提高植物抗盐性的关键基因。前期结果显示SSP1基因参与了植物对盐胁迫的响应，因此通过构建SSP1-GFP转基因植株，对SSP1基因的功能进行进一步探究，以期进一步解析SSP1基因在植物对盐胁迫响应中所起的作用。

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