加工条件对核桃蛋白质溶出率的影响

鹿旭　华欲飞　陈业明　张彩猛　孔祥珍

摘要 [目的]探讨加工条件对核桃蛋白溶出率的影响，为利用核桃蛋白以及核桃乳的加工工艺提供依据。[方法]以脱脂核桃粉为原料，研究了高速剪切、pH和加热这3种加工条件对核桃蛋白溶出率的影响。[结果]核桃蛋白在碱性pH中蛋白溶出率较高，热处理可以增大蛋白溶出率，增加高速剪切时间和提高剪切温度均可以使核桃蛋白溶出率增大。相同pH下，核桃蛋白经过高温剪切可以增大蛋白溶出率，pH 7.0条件下60 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由5.67%增加到16.45%；pH 8.0条件下60 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由24.33%增加到62.81%；pH 9.0条件下60 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由50.93%增加到76.65%；pH 10.0条件下80 ℃剪切5 min，蛋白溶出率由5787%增加到78.67%。[结论]经过电泳分析得知，高速剪切可以使原本不溶的核桃谷蛋白溶出，使核桃乳稳定。

关键词 核桃蛋白質；高速剪切；pH；加热温度；溶出率

中图分类号 TS255 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）13-0155-05

Effect of Processing Conditions on the Dissolution Rate of Walnut Protein

LU Xu， HUA Yufei， CHEN Yeming et al

（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi ，Jiangsu 214122 ）

Abstract [Objective]The influence of processing conditions on walnut protein dissolution rate was discussed， so as to provide basis for walnut protein and walnut milk processing technology. [Method]With skimmed walnut powder as raw material， the high speed shearing， pH and heating these three kinds of the effect of processing conditions on the walnut protein dissolution rate were investigated. [Result] The dissolution rate of the walnut protein in alkaline pH was high， the heat treatment could increase the protein dissolution rate， and the walnut protein dissolution rate increased with increasing the shear time and temperature of high shearing. At the same pH， the protein dissolution rate of walnut protein was increased after high speed shear at high temperature， under the condition of pH 7.0， shearing at 60 ℃ for 5 min， the protein dissolution rate of the walnut protein increased from 5.67% to 16.45%；under the condition of pH 8.0， shearing at 60 ℃ for 5 min， the protein dissolution rate of the walnut protein increased from 24.33% to 62.81%；under the condition of pH 9.0， shearing at 60 ℃ for 5 min， protein dissolution rate of the walnut protein increased from 50.93% to 76.65%；under the condition of pH 10.0 shearing at 80 ℃ for 5 min， protein dissolution rate of the walnut protein increased from 57.87% to 78.67%. [Conclusion]After electrophoresis analysis， it was found that the high speed shear could dissolve the original insoluble walnut gluten， and enabling the stability of walnut milk.

Key words Walnut protein；High speed shearing；pH；Heating temperature；Dissolution rate

核桃是四大坚果之一，在我国栽培历史悠久，种植面积也比较广泛，我国核桃的种植面积和产量均居世界之首[1-2]。核桃中的蛋白质和脂肪含量较高，并且营养成分丰富，其药用价值也逐渐被开发利用[3]。核桃仁中蛋白质含量高达15%～20%，属于优质的植物蛋白，被广泛应用到核桃乳等产品的加工制作中[4-5]。由于核桃蛋白主要由谷蛋白构成，谷蛋白不溶于水，溶于碱液，水溶性差，因此限制了核桃蛋白在食品中的应用。

蛋白质的溶解性是指蛋白质在水中的溶解能力，在食品加工中具有重要作用。关于核桃蛋白功能性质的研究也较多集中在蛋白的溶解性方面。崔莉等[6]对核桃分离蛋白在不同pH条件下的溶解性进行了研究，结果表明核桃蛋白的溶解性在pH 5.0左右时最差。Szetao等[7]对不同pH条件下脱脂核桃粉的溶解性进行了研究，发现核桃蛋白的溶解性在pH 4.0时最差，随着 pH升高，核桃蛋白的溶解性逐渐增加。姜莉[8]研究了温度对核桃蛋白溶解性的影响，发现核桃蛋白在55 ℃时溶解性达到最大值，继续升高温度溶解性会逐渐下降。

大部分未经改性的天然蛋白质在生产加工中不能充分发挥其功能性质，因此通常运用一些改性手段使蛋白质的功能性质得以改善，进而提高蛋白质的利用率。一些物理方法如机械振荡、高压均质和热反应等均可以对蛋白质进行改性[9]。化学改性是使用化学试剂对蛋白质进行结构修饰，使蛋白质内部的化学键发生断裂、重组，或者引入其他功能基团。pH对核桃蛋白的溶解性影响较大，在碱性条件下更有利于提高蛋白质的溶解性[6]。目前在安全性上被大众所接受的且广泛应用在工业中的化学改性是酸碱处理，盐酸和氢氧化钠是常用的pH调节剂[9]。

高速剪切是一种均质化技术，可以提高产品的提取率，效果好且耗能低，因此在有效成分的分离提取中应用广泛[10]。张彩猛等[11]将高速剪切技术应用到醇法大豆浓缩蛋白中对其进行改性研究，结果表明，经过高速剪切处理后大豆浓缩蛋白的溶解性提高。而高速剪切技术在核桃蛋白提取中的应用尚未见报道。调节pH、加热、剪切是核桃乳制备过程中常见的加工工艺。笔者以脱脂核桃粉为原料，探讨pH、加热温度、高速剪切条件对核桃蛋白溶出率的影响，为进一步利用核桃蛋白生产核桃乳的加工工艺提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原料与主要试剂：核桃仁，购于缤果世家网店，属云南大理生核桃仁；氢氧化钠、碳酸氢钠、浓盐酸、石油醚、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、叠氮钠、硫酸铜、硫酸钾、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、牛血清蛋白（BSA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、β-巯基乙醇（β-ME）、甘氨酸、三氯乙酸（TCA）、过硫酸铵和考马斯亮蓝G-250均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2，2′-联喹啉-4，4′-二二钠甲酸（BCA），苏州亚科科技股份有限公司。

主要仪器：

K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器有限公司；pH计、电子天平、AB204-N型分析天平，梅特勒-托利多有限公司；LGJ-18冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；磁力搅拌器，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；Himac CR21GⅡ型冷冻离心机，日本HITACHI公司；FA25型高速剪切机，弗鲁克流体机械制造有限公司；UV-2100型紫外分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；数显恒温水浴锅，金坛荣华仪器制造有限公司；DYY-8C型垂直电泳仪，北京市六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 核桃脱脂粉的制备。

将核桃仁去皮后用打浆机打浆、胶体磨磨浆后得到核桃浆，冷冻干燥。将冻干后的核桃浆与石油醚以料液比 1 ∶5（W/V）混合，充分混匀搅拌1 h后进行抽滤，收集抽滤后所得残渣再次脱脂，直至滤液无色透明，收集残渣放在通风橱内挥干溶剂，将所得的核桃脱脂粉于4 ℃保存备用。

1.2.2 核桃蛋白的分级分离。

核桃蛋白组分的分离提取方法参照毛晓英等[12]、Osborne[13]和Szetao [7]的方法略微改动。核桃中谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白的分离提取按照图1所示的方法进行。为了充分提取核桃中各蛋白组分，每个提取步骤重复2次，然后将各蛋白组分离心后的清液于4 ℃下透析48 h后冻干，将所得的蛋白冻干粉于4 ℃保存备用。

1.2.3 不同pH核桃蛋白样品的制备。

称取适量脱脂粉，与去离子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室温下充分混匀搅拌。调节溶液的 pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，搅拌提取2 h。

1.2.4 不同加热温度核桃蛋白样品的制备。

称取适量脱脂粉，与去离子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室温下充分混匀搅拌。调节溶液的pH为7.0，搅拌提取2 h，分别在温度20、40、60、80、100和121 ℃热处理20 min，之后冷却至室温。

1.2.5

不同剪切时间核桃蛋白样品的制备。

称取适量脱脂粉，与去离子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室温下充分混匀搅拌。分别调节溶液的pH 为 7.0、8.0、9.0、10.0，搅拌提取2 h。之后分别用高速剪切机在室温下10 000 r/min剪切2、4、6、8、10 min。

1.2.6 不同剪切温度核桃蛋白样品的制备。

称取适量脱脂粉，与去离子水以料液比1 ∶30（W/V）混合，室溫下充分混匀搅拌。分别调节溶液的pH 为 7.0、8.0、9.0、10.0，搅拌提取2 h。之后分别用高速剪切机在20、40、60、80 ℃温度下10 000 r/min剪切5 min。

1.2.7 蛋白溶出率的测定。

将制备好的核桃蛋白样品在4 ℃下以11 200 r/min离心25 min。取一定量的上清液采用BCA法测定蛋白质含量（以牛血清蛋白为标准蛋白），蛋白质溶出率的计算公式如下。

蛋白质溶出率（%）= 清液蛋白质含量×清液体积 脱脂粉蛋白质含量×脱脂粉取样量 ×100

1.2.8 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

核桃蛋白组分的凝胶电泳参照沈敏江的方法略微改动[14]。电泳中分离胶和浓缩胶的浓度分别为12.5%和40%。将样品溶于样品溶解液中，使蛋白浓度为2 mg/mL，再加入1%溴酚蓝，还原性SDS-PAGE需要在其中加入2%巯基乙醇，沸水浴加热5 min后10 000 r/min离心10 min，取上清液进样10 μL。分别用考马斯亮蓝G-250和去离水对凝胶进行染色和脱色。

1.2.9 核桃蛋白乳液的制备。

称取适量脱脂粉，与去离子水混匀使蛋白浓度为0.6%，分别调节溶液的pH 为 7.0、80，室温下充分混匀搅拌，加入2.0%大豆油，60 ℃剪切5 min使蛋白和油充分乳化。

1.2.10 核桃蛋白乳液的微观结构。

将制备好的核桃蛋白乳液摇匀后取10 μL滴加到载玻片上，缓慢盖好盖玻片避免产生气泡，然后用普通光学显微镜放大100倍进行观察。

1.3 统计分析

每个样品测定3次平行，试验数据用平均值±标准偏差来表示，作图工具为Origin 8.5。

2 结果与分析

2.1 核桃蛋白和蛋白组分

核桃蛋白的组分及比例如表1所示。由表1可以看出，核桃中主要包含4种蛋白，分别是谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白，所占比例分别为58.80%、2428%、8.01%和0.08%，还有8.84%是残余蛋白。核桃蛋白中谷蛋白所占的比例最大，接近60%；其次是球蛋白，所占比例接近25%；核桃蛋白中清蛋白和醇溶蛋白所占比例较小。这与毛晓英等[12]对核桃蛋白质及其分离组分的分析得到的结果类似。

由于核桃醇溶蛋白含量非常少，所以选取清蛋白、球蛋白和谷蛋白对核桃蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，目的是为了得到核桃蛋白组分的分子量分布情况，结果如图2所示。清蛋白的分子量分布范围比较广，非还原状态下分子量在10～250 kD范围内都有分布，还原状态下分子量分布在10～100 kDa，说明清蛋白分子间的巯基二硫键在还原状态下被打断。球蛋白在非还原状态下分子量主要在10～15、32～34、38～40、50～70 kD 4个区间，同时在18～22、200～270 kD也有蛋白分布；还原状态下分子量主要分布在17～20、32～35、45～73 kD，其中45～73 kD的蛋白条带为4个单独分开的条带，200～270 kD的蛋白条带消失。谷蛋白的电泳条带颜色比较深，在非还原状态下分子量主要集中在17～19、33～35、55～70和大于250 kD的区域；在还原状态下分子量主要集中在16～19、30～35、50～55和大于250 kD的区域，并且还原与非还原电泳条带在大于250 kD处的颜色都较深，说明谷蛋白多为分子量比较大的蛋白。

2.2 pH对核桃蛋白质溶出率的影响

由图3可以看出，在pH 2.0～12.0蛋白质的溶出率有显著差异。核桃蛋白质在中性和酸性pH中溶出率比较低，在pH 2.0～5.0，随着pH增加，蛋白溶出率由27.02%减少到7.04%；在pH 5.0～7.0，蛋白溶出率都低于10%。在碱性条件下，随着pH的升高，蛋白质的溶出率逐渐提高。在pH为8.0时，蛋白质溶出率为24.33%，到pH为11.0时，溶出率达73.19%，随后溶出率增加缓慢，到pH 12.0时，溶出率达78.37%。由于谷蛋白是核桃蛋白的主要组成成分，因此在碱性条件下由于大部分谷蛋白溶出，所以核桃蛋白的溶出率较高。

2.3 加热温度对核桃蛋白质溶出率的影响

由图4可以看出，在20 ℃时核桃蛋白溶出率为5.58%，随着加热温度的升高，核桃蛋白溶出率增大。当温度在40～100 ℃时，核桃蛋白溶出率差异不大。40 ℃时蛋白质溶出率为11.89%；当温度升至 60 ℃时，蛋白质溶出率略微增加，溶出率为1251%；当温度达到 80 ℃时，蛋白质溶出率略微下降，溶出率为1157%；100 ℃时，蛋白溶出率又略微增加至1246%；当温度继续升高到121 ℃时，蛋白溶出率达到1636%，比20 ℃时蛋白溶出率提高了10.78百分点，比40～100 ℃时蛋白溶出率提高了3.85～4.47百分点。这可能是由于在热处理的过程中蛋白质的共价键被部分打开，因此改善了溶解性[15]。

2.4 高速剪切对核桃蛋白质溶出率的影响

高速剪切可以使蛋白与蛋白之间相互挤压，在外力的作用下减小蛋白质粒径，增大其表面积[16]。由于在高速剪切的过程中蛋白质颗粒间的共价键会被破坏，所以使蛋白质的溶解度增加。为了研究高速剪切对核桃蛋白质溶出率的影响，分别选取pH 70～10.0和20 ～ 80 ℃范围对核桃蛋白的溶出率进行考察，防止在过酸、过碱和高温条件下对蛋白质的性质和营养价值造成破坏，以便应用到核桃蛋白的实际加工中。

剪切时间对核桃蛋白溶出率的影响如图5a所示。可以看出，蛋白溶出率随剪切时间的增加而增大。pH 7.0条件下，未剪切时溶出率为5.67%，剪切10 min后溶出率增加到1889%，提高了13.22百分点；pH 8.0条件下，未剪切时溶出率为24.33%，剪切8 min后溶出率达到47.61%，提高了23.28百分点；pH 9.0条件下，未剪切时溶出率为50.93%，剪切10 min后溶出率增加到58.97%，提高了8.04百分點；pH 10 .0条件下，未剪切时溶出率为57.87%，剪切10min后溶出率增加到70.67%，提高了12.80百分点。由此可以得出，增加剪切时间可以促进核桃蛋白质溶出，但相对于pH而言，在剪切时提高蛋白质溶液的pH比增加剪切时间对蛋白的增溶效果更显著。

剪切温度对核桃蛋白溶出率的影响如图5b所示。可以看出，pH 7.0条件下，核桃蛋白经过60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由5.67%增加到16.45%，提高了10.78百分点；pH 8.0条件下，核桃蛋白经过60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由24.33%增加到62.81%，提高了34.48百分点；pH 9.0条件下，核桃蛋白经过60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由5093%增加到76.65%，提高了25.72百分点；pH 10.0条件下，核桃蛋白经过80 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由57.87%增加到78.67%，提高了20.80百分点。由此可以得出，升高剪切温度可以促进核桃蛋白质溶出，但相对于pH而言，在剪切时提高蛋白质溶液的pH比升高剪切温度对蛋白的增溶效果更显著。

2.5 高温剪切对溶出核桃蛋白质SDS-PAGE条带的影响

为了考察在中性条件下和在碱性条件下高温剪切后溶出蛋白的差异，分别选取pH 7.0、8.0高温剪切前后溶出的核桃蛋白质进行电泳分析，结果如图6所示。不同分子量下还原电泳各泳道蛋白比例见表2。可以看出，在还原状态下，pH 7.0高温剪切后溶出的蛋白（图6 a 泳道2）在分子量50～75 kD的比例增加，由21.01%增加到36.10%，增加了1509百分点；在分子量18～21 kD的比例增加，由32.57%增加到34.30%，增加了1.73百分点。pH 8.0高温剪切后溶出的蛋白（图6 a 泳道4）在分子量30～35 kD的比例增加，由32.72%增加到45.81%，增加了13.09百分点；在分子量18 ～21 kD的比例增加，由29.01%增加到29.30%，增加了0.29百分点。条带颜色加深的区域对应的蛋白既有清蛋白、球蛋白，又有谷蛋白，但只有清蛋白和球蛋白2种蛋白不足以使蛋白的比例增加如此多，说明谷蛋白同样起到了作用，由此推测高温剪切可以使谷蛋白增溶。

2.6 核桃蛋白质的乳化性

为了将高速剪切工艺应用到核桃蛋白的实际加工中，分别对中性条件下和碱性条件下高温剪切后蛋白的乳化性进行考察，其中碱性条件以pH 8.0高温剪切后溶出的蛋白为代表。图7为pH 7.0、8.0条件下

60 ℃剪切5 min后核桃蛋白质的乳化性。由显微图片可以

看出，pH 7.0高温剪切制备的核桃蛋白乳状液的乳化性不好，蛋白和油滴之间形成了聚集体，且有很多小油滴在聚集后融合成大油滴；pH 8.0高温剪切制备的核桃蛋白乳状液的乳化性较好，显微图片中无大量聚集体出现，蛋白和油分散的较均匀。由此说明，高速剪切对核桃蛋白的乳化作用在碱性条件下好于在中性条件下。

3 结论

核桃蛋白中，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的含量分别为8.01%、24.28%、0.08%和58.80%，核桃中主要蛋白成分是谷蛋白。核桃蛋白在中性和酸性pH中溶出率比较低，在碱性pH中溶出率比较高，在pH 2.0～5.0，随着pH增加，蛋白溶出率由27.02%减少到7.04%；在pH 5.0～7.0，蛋白溶出率都低于10%；在pH 8.0～12.0，随着pH增加，蛋白溶出率由24.33%增加到78.37%。核桃蛋白在经过加热之后，可以增加它的蛋白溶出率，当温度由20 ℃升高到121 ℃，蛋白溶出率由5.58%增加到16.36%。高温剪切可以使核桃蛋白增溶，在pH 7.0、8.0、9.0、10.0条件下，经过高温剪切的蛋白溶出率均比未经高温剪切的蛋白溶出率高。pH 7.0条件下，核桃蛋白在60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由5.67%增加到1645%；pH 8.0条件下，核桃蛋白在60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由24.33%增加到62.81%；pH 9.0条件下，核桃蛋白在60 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由50.93%增加到76.65%；pH 10.0条件下，核桃蛋白在80 ℃剪切5 min后，蛋白溶出率由57.87%增加到78.67%。通过电泳分析高速剪切前后溶出的蛋白得知，高速剪切可以使原本不溶的核桃谷蛋白溶出。将该工艺应用到核桃乳的制备中，可以提高核桃蛋白的乳化性，促进核桃乳稳定。

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