大鼠MKK3蛋白的生物信息学分析

赵小峰　吴桂梅　金磊　汪瑶　贺玲

摘要 [目的] 对大鼠MKK3蛋白进行生物信息学分析，预测其结构和功能，可以为进一步研究大鼠MKK3蛋白的功能提供试验基础。[方法] 利用生物信息学工具对大鼠MKK3蛋白的理化性质、跨膜区域、空间结构、磷酸化位点、相互作用等进行预测。[结果] 大鼠MKK3蛋白由347个氨基酸残基组成，等电点为7.05，相对分子质量39.3 kD，在哺乳动物中高度保守。二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构成，结构上含一个S_TKc结构域。MKK3能与多种MAPK、Tab1、Tab2、Traf6等蛋白发生相互作用。[结论] 大鼠MKK3蛋白是一种不含信号肽和跨膜区的亲水蛋白，具有激酶活性，可参与p38MAPK信号通路在炎症和肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。该研究为进一步研究大鼠MKK3蛋白的功能提供了试验依据。

关键词 大鼠；MKK3；序列分析；生物信息学分析

中图分类号 Q789 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）13-0114-04

Bioinformatic Analysis of Rat MKK3 Protein

ZHAO Xiaofeng，WU Guimei，JIN Lei et al

（National Demonstration Center for Experimental Basic Medical Science Education， Xuzhou Medical University，Xuzhou，Jiangsu 221004）

Abstract [Objective]To predict the structure and function of rat MKK3 protein with bioinformatics.[Method] The bioinformatic tools were used to predict physical and chemical properties， transmembrane region，spatial structure，phosphorylation sites and proteinprotein interaction of MKK3 protein.[Result]Rat MKK3 contained 347 amino acid residues，the theoretical isoelectric point was 7.05，the calculated molecular mass was 393kD， and it was highly conservative in mammal. The signal peptide and transmembrane regions were not found in rat MKK3. The main compositions of protein secondary structure were alphahelix ，betaextended strand and random coil， which contained one S_TKc domain. The proteins interaction with rat MKK3 were MAPK，Tab1，Tab2，Traf6.[Conclusion]Rat MKK3 protein is a hydrophilic protein without signal peptide and transmembrane regions， the protein acts as protein kinases and involves in the activation of p38 MAPK signal pathway may play an important role in inflammation injury and tumor progress.Our research can provide useful information for the further study of rat MKK3.

Abstract Rattus norvegicus；MKK3；Sequence analysis；Bioinformatic analysis

絲裂原活化蛋白激酶激酶3（Mitogenactivated protein kinase kinase 3，MAP2K3，MKK3）是双重特异性蛋白激酶（dualspecificity protein kinase group， DSK）家族成员， 也是p38MAPK信号通路的重要成员。在不同应激和炎症因子刺激作用下，上游的转化生长因子β活化激酶1（TAK1）、凋亡信号调节激酶1（ASK1） 等MKKK激酶通过Ser 189和Thr 193磷酸化激活MKK3[1-3]，MKK3进一步活化p38进而激活p38MAPK信号通路，参与细胞的分化、运动、分裂、死亡等过程。一系列研究发现MKK3也参与肿瘤的浸润和进展[4-6]。表明MKK3对炎症反应和肿瘤的发展起重要作用。目前MKK3激酶在p38 MAPK信号通路中如何与其他蛋白相互作用及其调节机制还不清楚。为进一步阐明MKK3在p38 MAPK信号通路中的组装及作用机制，笔者对大鼠MKK3蛋白进行生物信息分析，为研究MKK3在p38 MAPK信号通路中的组装及作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 登录NCBI 主页进入GenBank 下载大鼠和其他物种MKK3的基因和蛋白序列。

1.2 方法

以大鼠MKK3的基因和蛋白序列为材料，应用在线软件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析MKK3蛋白的相对分子质量、氨基酸组成、等电点（pI）、

原子组成、稳定性、半衰期、疏水性。采用SignalP 4.1软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测MKK3蛋白是否含有信号肽。利用NetPhos 2.0 软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）对MKK3蛋白进行分析，判断蛋白是否含有磷酸化位点。通过GORⅣ、SMART软件预测MKK3蛋白的二级结构[7]。采用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de）、EXPASY （http：//swissmodel.expasy.org/）软件分析蛋白质的功能域和三级结构。之后利用STRING数据库研究相关蛋白之间的相互作用，最后应用MEGA5 软件进行氨基酸序列多重比对和分子进化分析[8]。

2 结果与分析

2.1 大鼠MKK3蛋白的理化性质分析

采用在线软件ProtParam分析大鼠MKK3蛋白的理化性质，结果显示该蛋白由347个氨基酸组成，相对分子质量39.3 kD，分子式C1747H2783N473O516S20，pI为7.05。带正电荷的氨基酸残基（赖氨酸+精氨酸）46个，带负电荷的氨基酸残基 （谷氨酸+天冬氨酸） 46个。估计MKK3蛋白在哺乳动物的网织红细胞中半衰期为30 h，不稳定系数（Ⅱ）是47.70，根据不稳定指数的判断标准：小于40被认为是稳定，高于40为不稳定[9]，推定MKK3蛋白属于非稳定蛋白。

2.2 大鼠MKK3蛋白的亲水性/疏水性分析

利用ProtScale 程序对大鼠MKK3蛋白的亲疏水性进行在线分析，结果如图1所示，该蛋白存在3个高分值（score>1.5）区，即第169、170和173位氨基酸区，第255、258～260位氨基酸区，第339位氨基酸，其中最大值是第173位的异亮氨酸（2167）。而低分值（score<0） 区较多，最小值是第20位的赖氨酸（-3.256）。进一步研究发现，大鼠MKK3蛋白中的339个氨基酸（5～343），有63.13% （214个） 分布在低分值区，36.87% （125个） 分布在分值>0的区域，这说明大鼠MKK3蛋白存在明显的亲水域，属亲水性蛋白质。这一结果与ProtParam程序分析得出的结果一致：大鼠MKK3蛋白脂肪族氨基酸指数83.11，总的亲水性平均系数（GRAVY）为-0.326，显示该蛋白为亲水蛋白质。

2.3 大鼠MKK3蛋白的信号肽及核定位序列预测

利用信号肽预测服务器SignalP 4.1 Server预测大鼠MKK3蛋白的信号肽，预测结果如图2所示，通过程序计算得出C、Y、S 的最大值分别为0.109、0.104、0.123，S-mean、D 值分别为0.099、0.101，通过这些数据可以得出大鼠MKK3蛋白无信号肽。

通過核定位序列预测系统cNLS-mapper 对其进行分析发现存在2个核定位序列：①第16～45位氨基酸残基处（score=5.2），全序列为KGKSKRKRDLRISCVSKPPVSNPTPPRNLD，②第306～334位氨基酸残基处（score =6.1），全序列为LRKNPAERMSYLELMEHPFFTLHKTKKTD。2段核定位信号中碱性氨基酸（精氨酸+赖氨酸）的总和是15个。

2.4 大鼠MKK3蛋白的跨膜区预测与分析

大鼠MKK3蛋白的跨膜结构使用TMHMM程序进行预测，通过计算得到图3。结果显示大鼠MKK3蛋白347个氨基酸残基全部在膜外，不存在跨膜区域，这说明大鼠MKK3蛋白是非跨膜蛋白质。

2.5 大鼠MKK3蛋白的磷酸化位点分析

利用NetPhos 20、GPS 3.0程序分析大鼠MKK3蛋白的磷酸化位点，通过分析发现该蛋白可能含有53个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点26个，苏氨酸磷酸化位点18个，酪氨酸磷酸化位点9个，结果如图4。

2.6 大鼠MKK3蛋白的二级结构分析

使用GORⅣ、SMART对大鼠MKK3蛋白的二级结构进行分析，结果表明，大鼠MKK3蛋白由30.26%的α-螺旋（H）、21.33%的β-折叠（E）、48.41%的无规卷曲构成（C）（图5），这些构件分布于多肽链不同位置，在局部形成有序结构，有利于蛋白质功能的发挥。该蛋白在64～325位氨基酸残基处有一个高度保守的结构域：S_TKc domain（图6），该区域是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域，表明蛋白具有蛋白激酶活性，在信号通路中能磷酸化并激活下游靶蛋白。

2.7 大鼠MKK3蛋白三级结构分析及相互作用蛋白质预测

将大鼠MKK3蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model软件进行三级结构预测，得到了1个预测结果，如图7 所示：在三级结构中蛋白无规卷曲分布较多，而α-螺旋、β-折叠在中间区分布较集中，体现出蛋白功能区相对集中，有利于蛋白作用的发挥，这与二级结构中预测的结构元件分布大致相同。

使用STRING数据库分析预测能与大鼠MKK3蛋白相互作用的蛋白质，得到了如图8 所示的蛋白质相互作用网络，该网络中标注了前10位与大鼠MKK3相互作用紧密的蛋白质。从图中可以看到能与大鼠MKK3相互作用的大部分是丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）家族成员，并且这些激酶之间也存在紧密的相互作用关系。通过对这些预测结果进行分析，可以判定大鼠MKK3蛋白的主要作用方式可能是磷酸化并激活靶蛋白，从而完成信号的传递。结合前面分析得到大鼠MKK3含有核定位信号，表明该蛋白有可能通过核孔复合体进入细胞核发挥作用，这也体现MAPK家族是细胞信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者。

2.8 大鼠MKK3蛋白进化分析

从MEGA5 软件构建的系统进化树（图9） 可以看出，大鼠MKK3与小鼠、中国仓鼠距离较近，说明它们之间有高度同源性，与它们都属于啮齿类的动物分类关系一致。此外，大鼠、小鼠等啮齿动物与人、牛、羊、猪等哺乳动物之间的进化距离很小，表明该蛋白在哺乳动物之间具有很高的保守性，在哺乳动物中可能具有相似的激酶调节功能。

3 讨论

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一类广泛分布于胞浆内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物中，MAPK可以被细胞内外各种物理应激、细胞因子、渗透压力、毒素、电离辐射、脂多糖等刺激激活[10-11]，参与调节细胞的生长发育、存活、分裂、分化、凋亡及自噬等生命过程，同时MAPK也能活化下游蛋白激酶，参与多种细胞信号的识别、传递及放大等过程[12]。MAPK信号通路主要有MKK4/7-JNK信号通路、MKK3/6-p38信号通路、MEK1-ERK1/2 信号通路及MKK5/ERK5 信号通路[13]，p38 MAPK 通路是其中重要的一条信号通路。MKK3是p38上游主要的激酶，在应激和其他刺激条件下MKK3促使p38MAPK的Thr-Gly-Tyr位点发生磷酸化而活化，激活的p38MAPK可将信号转导至细胞核启动相关靶基因转录，也能将信号转导至其他细胞组件以产生不同的细胞应答反应[14-15]。研究发现，siRNA敲除小鼠和骨髓源性巨噬细胞MKK3后，炎症细胞线粒体膜电位得到提高，线粒体功能逐渐恢复[16]。在LPS诱导全身炎症反应综合征（SIRS）试验中，敲除MKK3后小鼠肺部的炎症反应减轻，线粒体内活性氧簇也减少[17]。说明MKK3在炎症细胞循环和线粒体活性氧损伤中发挥重要作用。近期研究还发现神经胶质瘤中的MKK3也是p38 MAPK的主要激活因子，MKK3的活性与p38活性密切相关，MKK3参与神经胶质瘤和乳腺癌细胞的侵袭和进展[4]。Gurtner等[5]研究发现肿瘤细胞p53突变后能结合并激活MKK3及调节MKK3基因的表达，敲除MKK3后肿瘤细胞的增殖能力和存活率减少。进一步研究还发现，MKK3敲除后只对野生型p53癌细胞的增殖和生长有影响，对正常细胞无影响。此外MKK3敲除还增加癌细胞对化疗药物的生物反应[6]。以上研究表明MKK3在应激反应、炎症、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。因此对MKK3蛋白的理化性质、结构特点进行分析将会对其功能有较深入的了解。

该研究利用生物信息学工具对大鼠MKK3蛋白相关信息进行预测分析，研究发现大鼠MKK3蛋白是由347个氨基酸组成的无信号肽、无跨膜结构的亲水蛋白质，推测该蛋白pI为7.05，不稳定系数（Ⅱ）是47.70，该蛋白为不稳定蛋白。大鼠MKK3二级结构包含30.26%的α-螺旋、21.33%的β-折叠、48.41%的无规卷曲，含有53个磷酸化位点，能在外界刺激下发生磷酸化而被激活。在64～325位氨基酸残基处有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域：S_TKc domain，说明该蛋白具有激酶活性，能通過蛋白激酶活性使与之结合的MAPK、Tab1、Tab2、Traf6等活化，调节相关信号通路的信息传递，从而调节机体正常生理和病理过程。因此，利用生物信息学方法得到大鼠MKK3蛋白的预测结果，对深入研究大鼠MKK3在p38 MAPK信号通路中的组装及寻找新的治疗靶点具有积极指导意义。

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