玉叶金花SSR—PCR体系的优化

郑艳　胡章立　陈涛

摘要 [目的]优化玉叶金花SSR-PCR扩增反应体系。[方法]以红纸扇为材料，采用正交设计和单因素试验方法，从Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA浓度以及退火温度4个方面对玉叶金花SSR-PCR体系进行优化，并采用4对SSR引物和4种玉叶金花植物样品进行验证。[结果]玉叶金花20 μL的 SSR-PCR反应最优体系为Mg2+浓度1.50 mmol/L、dNTPs浓度0.150 mmol/L、引物浓度0.45 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.00 U、模板DNA 15 ng、退火温度53.4 ℃。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好，可用于玉叶金花的SSR分子标记开发、物种分子鉴定、遗传多样性分析和谱系关系构建等相关研究。

关键词 玉叶金花；正交设计；SSR分子标记；PCR体系优化

中图分类号 S188 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）13-0098-06

Optimization of SSR-PCR System for Mussaenda L.

ZHENG Yan1，2，HU Zhangli1，CHEN Tao1，2*

（1.College of Life Sciences and Oceanography，Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518060；2.Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，CAS， Shenzhen，Guangdong 518004）

Abstract [Objective]To optimize SSR-PCR amplification reaction system for Mussaenda by orthogonal design.[Method]The orthogonal design and single factor test were adopted to optimize the SSR-PCR system using M.erythrophylla genomic DNA as template.Six factors including the concentration of Mg2+，dNTPs，Taq DNA polymerase，primer，DNA template and annealing temperature were tested separately in this system，which was further verified by four primers and samples of four Mussaenda species.[Result]The optimized SSR-PCR reaction system condition was obtained in a 20 μL system containing 1.50 mmol/L Mg2+，0.150 mmol/L dNTPs，0.45 μmol/L SSR primer，2.00 U Taq DNA polymerase and 15 ng DNA template，and the annealing temperature 53.4 ℃.[Conclusion]With clear，stable and reproducible bands，the system can be used for SSR maker development，germplasm identification，genetic diversity and relationship analyses.

Key words Mussaenda L.；Orthogonal design；SSR molecular marker；PCR system optimization

玉叶金花属（Mussaenda L.）植物属于茜草科（Rubiaceae）金鸡纳亚科（Cinchonoideae）玉叶金花族（Mussaendeae），主要分布于非洲、亚洲及西南太平洋岛屿，全世界有130多种，我国玉叶金花属植物约有28种，主产于西南部至东南部以及西藏和台湾[1-3]。玉叶金花属植物一般为缠绕藤本、灌木和小乔木，主要特征是具有扩大的花瓣状萼叶，不开裂浆果，具有较高的观赏价值[4]。部分玉葉金花属植物全株可入药，有清热解毒、去湿、止渴、活血化瘀等功效，也可作为凉茶配料，预防感冒等，有的种类提取物还具有抗菌和抗癌等功效[5-6]，因此玉叶金花具有重要的开发利用价值。

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）在真核和原核生物基因组中分布广泛。SSR分子标记具有共显性、多态性高、易检测、操作简单等优点，在植物的亲缘关系鉴定、遗

传多样性分析、DNA指纹图谱构建、分子标记辅助育种等方

面应用广泛[7-10]。目前，基于SSR标记技术的玉叶金花属植物的研究较少，结果不够理想[11-13]。笔者采用正交试验设计和单因素试验相结合，对SSR-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA的浓度以及退火温度进行优化，以期为后续玉叶金花SSR分子标记的全面开发、遗传多样性分析和分子分类鉴定等相关研究提供参考和应用。

1 材料与方法

1.1 材料

以红纸扇、大叶玉叶金花、广东玉叶金花、墨脱玉叶金花为材料，材料采自广东省深圳市仙湖植物园玉叶金花保育与研发基地。采集幼嫩健康的叶片用硅胶进行干燥处理，其中红纸扇用于SSR-PCR体系优化试验，验证试验采用4种样品（表1）。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂。DL2000 DNA Marker、PCR扩增所用的10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶均购于宝生物工程（大连）有限公司。 试验所用的SSR引物由赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成，其中引物M8用于正交试验及单因素试验，引物M2、M10和M11用于体系验证试验（表2）。

1.2.2 主要仪器。NanoDrop 2000超微量分光光度计、BIO-RAD T100TM Thermal Cycler、DYCP-31DN水平电泳仪购于北京六一仪器厂、BIO-RAD全自动凝胶成像系统。

1.3 方法

1.3.1 玉叶金花基因组DNA提取。采用CTAB法提取玉叶金花基因组DNA[14]，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测DNA浓度，并用TE buffer稀释至50 ng/L备用。

安徽农业科学 2018年

1.3.2 正交试验设计。采用L16（45）正交设计，对玉叶金花SSR-PCR体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、模板DNA用量进行5因素4水平的优化试验。SSR-PCR总反应体系为20 μL，除上述5个变化因素外，每个体系还包含2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O补齐，每个处理重复3次（表3、4）。

1.3.3 单因素试验设计。

利用正交试验设计中16组试验的结果，选出1组结果最佳的浓度组合，以此为基准进行PCR体系单因素试验，进一步优化SSR-PCR体系。每个因素设置8个水平，每个处理重复3次（表5）。

1.3.4 SSR-PCR扩增及检测。PCR反应在BIO-RAD T100TM Thermal Cycler上进行，采用Touchdown PCR扩增程序[15]：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，7个循环且每个循环降低1 ℃；之后94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR反应的结果用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，以DL2000 DNA Marker作为对照，采用BIO-RAD全自动凝胶成像系统观察并拍照。

1.3.5 退火温度的优化。选用以上试验所得最佳反应体系，对SSR引物退火温度进行筛选。设置退火温度为48～65 ℃，用BIO-RAD T100TM Thermal Cycler自动生成8个退火温度：48.0、49.0、50.7、53.4、56.5、59.1、60.9、62.0 ℃。

1.3.6 反应体系验证。通过正交试验和单因素试验筛选出玉叶金花SSR-PCR最佳反应体系以及最佳退火温度，使用4对引物M2、M8、M10和M11对4个不同种的玉叶金花样品进行PCR扩增，重复2次，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测，以验证反应体系的可靠性和稳定性。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果 用CTAB法提取的玉叶金花基因组DNA OD260/OD280为1.81～1.91，浓度为105～243 ng/μL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，说明DNA完整性好，可用于SSR-PCR试验（图1）。

2.2 正交试验结果分析

由图2可知，L16（45）正交设计的16个处理3次重复的结果，因Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物及DNA浓度的不同组合，扩增效果出现了明显差异。第2、3、4、5、6、11、12、14、16组条带模糊，出现弥散现象，且结果不稳定；第1和13组扩增结果较稳定，但条带不清晰；第7、8、9和15组扩增条带明亮，较清晰；第10组条带最明亮、清晰，条带大小与理论值相符，无引物二聚体，且重复性好，亮度一致。

根据对各组合扩增结果的比较分析，第10组的各种因素组合为最佳选择，即20 μL反应体系中含2.00 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、2.00 U Taq DNA聚合酶、0.50 μmol/L 引物及20 ng DNA。

2.3 单因素试验结果分析

以SSR-PCR正交试验结果最好的第10组为基准，对Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA這5个因素进行单因素试验，图3为1次试验的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

2.3.1 Mg2+浓度对SSR-PCR反应的影响。

Mg2+通过调控Taq DNA聚合酶的活性影响PCR反应。由图3可知，随着Mg2+浓度的升高，PCR产物条带的亮度呈先升高后降低的趋势，说明Mg2+浓度过低或过高都会影响PCR扩增效率。第3组即Mg2+浓度为1.50 mmol/L时，条带最为明亮，因此Mg2+最佳浓度选用1.50 mmol/L。

2.3.2 dNTPs浓度对SSR-PCR反应的影响。dNTPs是PCR反应的底物，该试验中dNTPs的浓度不同时，PCR扩增结果相当，影响不大，因此选择正交试验结果中的最佳浓度0.150 mmol/L。

2.3.3 Taq DNA聚合酶浓度对SSR- PCR反应的影响。Taq DNA 聚合酶浓度低时，扩增产物浓度低，结果不理想，随着浓度的增加，扩增的条带亮度上升。由图3可知，当Taq DNA聚合酶的量低于1.00 U时，条带很淡，高于1.00 U时扩增效果较好，当Taq DNA聚合酶为2.00 U时，条带最为清晰，扩增效果最好，因此最佳选择是2.00 U。

2.3.4 引物浓度对SSR-PCR反应的影响。。

SSR引物浓度对PCR结果的影响不是很大，其中第4、5、6、7和8组条带清晰，扩增效果均很好，第1、2、3组相对较差，即引物浓度为045～0.65 μmol/L时，PCR结果很好，浓度为0.30～0.40 μmol/L时扩增结果稍差。引物浓度过高时，容易产生非特异性扩增及引物二聚体，综合考虑到成本，选择浓度较低的第4组，即引物浓度的最佳选择为0.45 μmol/L。

2.3.5 模板DNA浓度对SSR-PCR反应的影响。由图3可知，DNA模板对PCR扩增的影响较大，随着DNA浓度的增高，条带逐渐变淡，最低浓度15 ng为最佳选择。

2.4 退火温度筛选结果分析

在PCR反应中，退火温度影响引物与模板的特异性结合。由图4可知，在8个不同退火温度下，均能扩增出目的条带。在退火温度为48.0、49.0、50.7、53.4 ℃时，扩增结果条带明亮，清晰；当退火温度高于53.4 ℃时，条带亮度较弱。因此在48.0～53.4 ℃内，扩增效果较好。退火温度过高会影响PCR扩增的效率，而退火温度较低时，容易出现引物二聚体，所以选择53.4 ℃为最佳退火温度。

2.5 体系验证试验结果分析

应用SSR-PCR正交试验和单因素试验结果所得到的最佳反应体系，选用4对SSR引物M2、M8、M10和M11对4种玉叶金花样品进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增条带清晰、明亮，与预期产物大小相符，无引物二聚体，试验结果稳定，重复性好（图5）。

综上所述，玉叶金花SSR-PCR的20 μL最佳反应体系为1.50 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、0.45 μmol/L引物、2.00 U Taq DNA聚合酶、15 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O补齐，最佳退火温度为53.4 ℃。

3 讨论

SSR标记作为一种重要的分子标记，在物种的遗传多样性分析、种群遗传结构分析、物种系统进化关系分析、遗传图谱构建、品种鉴定和分子标记辅助育种等方面具有广泛的应用[9，16]。SSR-PCR反应的扩增效果受诸多因素影响，探索玉叶金花SSR的最佳PCR反应体系，对SSR分子标记在玉叶金花属植物研究中的应用十分关键。

该研究采用正交设计和单因素试验相结合的方法对玉叶金花SSR-PCR反应体系进行优化，其中正交试验能够均衡各個试验因素，综合各因素之间的交互作用，以便快速找出最佳的组合。在正交试验的基础上，结合单因素试验设计，充分考虑到各因素的影响，提高了试验结果的准确性[17-19]。

SSR-PCR反应体系中，各因素交互影响。Mg2+能够影响Taq DNA聚合酶的活性，还会与dNTPs结合，产生拮抗作用[20]。dNTPs浓度过高，容易产生引物二聚体和非特异性扩增，还会与Mg2+结合导致Taq DNA聚合酶的活性降低。Taq DNA聚合酶浓度过低会导致活性不够，反应不充分；浓度过高不仅浪费原料，还会降低反应的特异性。引物的特异性及稳定性会影响扩增产率，引物浓度过低会导致产量下降或扩增失败，浓度过高则容易引起碱基错配，形成引物二聚体[21-22]。

在绣球[18]、红椿[23]、绿豆[24]等植物的研究中发现Mg2+浓度对SSR-PCR反应的影响最大。该研究中，PCR的效果随着Mg2+浓度的上升呈现先上升后下降的趋势，这与众多研究结果类似，但是Mg2+浓度的变化并未导致扩增失败，可能是由于该研究所设计的浓度梯度变化不大。在大多数研究中，PCR反应对DNA模板的量要求很宽泛，认为模板DNA对反应影响最小[19，24]。该研究结果显示，随着DNA模板浓度的提高，PCR反应效果明显下降。这可能是由于玉叶金花材料中多糖等其他成分的含量较高，而该试验采用的CTAB法提取基因组DNA，未能将杂质去除干净，琼脂糖电泳检测结果显示模板DNA主带明显，但浓度不高，含有杂质。在DNA浓度高的同时，因杂质含量较高，从而影响了PCR反应结果。PCR试验对模板DNA含量要求不高，因此仅15 ng便能满足试验要求，并且效果很好。然而，玉叶金花模板DNA的提取及纯化方法还需要改进。退火温度影响PCR反应中引物与模板的特异性结合。退火温度过高会影响PCR扩增的效率；退火温度过低时，容易发生错配，出现引物二聚体，该试验筛选出53.4 ℃为最佳退火温度。

该研究通过正交试验设计，结合单因素试验，建立了玉叶金花SSR-PCR反应的最优反应体系：1.50 mmol/L Mg2+、0.150 mmol/L dNTPs、0.45 μmol/L引物、2.00 U Taq DNA聚合酶、15 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer，用ddH2O补齐至20 μL，最佳退火温度53.4 ℃。此反应体系可用于玉叶金花属植物的SSR引物开发、物种分类鉴定、遗传多样性和种群遗传结构分析等方面的研究。

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