一株山羊源肠炎沙门氏菌对小鼠的致病性研究

谭烁 冯帆 陈极奎 汤承　岳华

摘要 [目的]探討山羊源肠炎沙门氏菌（swun3816）对小鼠的致病性。[方法]从四川省某山羊养殖场腹泻粪便中分离出1株肠炎沙门氏菌，采用灌胃途径测定swun3816 对BALB/c小鼠的半数致死量，根据毒力测定结果选择合适的剂量，建立swun3816感染小鼠模型，并于感染后6、12、24、48、72、96 h随机选择3只小鼠进行剖检，观察其大体病变，同时采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肠道等器官，制备石蜡切片，观察其病理组织学变化。[结果]经灌胃途径接种102～108 CFU/mL swun3816均可致小鼠的不同程度发病和死亡，LD50为155.6 CFU/只；用5×103 CFU/只剂量给小鼠灌胃，建立了swun3816小鼠模型，感染小鼠最初出现精神沉郁、食欲减退和眼部浆液性渗出物等症状，感染后8.5 h开始出现死亡，第6天出现死亡高峰，剖检可见肺脏淤血和出血斑，脾脏淤血肿大，肝脏表面有大小不一的不规则灰白色坏死灶；肠液分泌增多呈黄色，小肠黏膜出血，肠壁变薄。病理组织学观察显示，肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、心脏出现变性、坏死和炎性细胞浸润等病变，十二指肠、空肠和回肠绒毛断裂脱落；盲肠、结肠、直肠在整个试验期间未见明显病变。[结论]山羊源肠炎沙门氏菌swun3816能引起小鼠全身性感染，具有很强的致病力。

关键词 肠炎沙门氏菌；致病性；病理组织学变化；山羊

中图分类号 S852.61+2 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）13-0090-05

Study on the Pathogenicity of a Strain of Salmonella enteritidis from Goat to Mice

TAN Shuo，FENG Fan，CHEN Jikui et al （College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan 610041）

Abstract [Objective] To investigate the pathogenicity of Salmonella enteritidis strain （swun3816）from goat to mice.[Method] A strain of Salmonella enteritidis was isolated from the faeces of diarrhea goats in a goat farm of Sichuan Province.The median lethal dose（LD50） of swun3816 strain to BALB/c mice was determined by intragastric administration.The appropriate dose was selected according to the determination results of toxicity and the pathological model of swun3816 infected mice was established.Three mice were randomly chosen to make autopsy after infecting 6，12，24，48，72 and 96 h.And the general pathological changes were observed，and heart，liver，spleen，lung，kidney，intestinal tract and other organs were collected to make parafin sections and observe histopathological changes.[Result] When mice was injected with 102～108 CFU/mL swun3816 strain by intragastric administration，different levels of morbidity and death were caused，LD50 was 155.6 CFU/ind..When the intragastric dose was 5×103 CFU/ind.，pathological model of swun3816 strain was established.At first，the infected mice performed the symptoms of depression，loss of appetite and serious exudate in the eyes，etc..The death appeared after infecting 8.5 h and the peak of the death appeared on the sixth day.From the autopsy results，blood spots in lungs，congestion in swollen spleens，and irregular grayish necroses on liver surface were found.Intestinal lesion included increased yellow secretion，bleeding intestinal mucosa and thinning intestinal wall.Histological and pathological examination showed degeneration，necrosis and inflammatory cell infiltration were seen in liver，kidney，lung，spleen and heart.The intestinal villi of duodenum，jejunum and ileum broke off and fell away，while cecum，colon and rectum remained normal in all experiments.[Conclusion] Salmonella enteritidis swun3816 strain from goat could cause systemic infection in mice with a strong pathogenicity.

Key words Salmonella enteritidis；Pathogenicity；Histopathological change；Goat

绝大多数沙门氏菌对人和动物都有致病性，很容易在动物与动物、动物与人以及人与人之间传播[1]。沙门氏菌在宿主肠道内生长繁殖，通过肠上皮细胞进入体内，并通过血液循环导致全身感染和菌血症，引起发热及腹泻[2]。畜禽携带的沙门氏菌很容易通过动物产品的食物链成为人类的重要来源[3-4]，沙门氏菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒的42.6%～60.0%，在世界大多数国家沙门氏菌引起的食源性疾病占微生物性食源性疾病的首位[5]，在我国，沙门氏菌性食物中毒事件多年来也一直占据细菌性食物中毒事件的首位[6]，世界卫生组织（WHO）将沙门氏菌列入具有严重危害和中等危害的食物传播性病原。据欧洲食品安全局（EFSA）报道，匈牙利2013年零售的生鲜畜禽肉中沙门氏菌平均检出率为18.6%[7]；Mihaiu等[8]报道罗马尼亚生鲜鸡肉、猪肉中沙门氏菌的平均检出率为22.9%；Thai等[9]报道越南鲜鸡、猪肉中沙门氏菌的平均检出率均为41.1%。畜禽感染沙门氏菌后可呈无症状带菌，会降低动物的繁殖力，或者可能加重病情或死亡率，也引起致死性疾病，造成巨大的经济损失。肠炎沙门氏菌主要引起人类的食物中毒和胃肠炎以及畜禽的肠炎。王晶晶等[10]研究表明四川省部分集约化山羊养殖场沙门氏菌的健康带菌率为54.59%。迄今为止，国内对山羊源肠炎沙门氏菌致病性的研究资料甚少。笔者对一株山羊源肠炎沙门氏菌对小鼠的致病性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 培养基及试剂

BPW增菌液、TTB增菌液、SS培养基，均购自杭州微生物试剂公司；沙门氏菌A-F多价诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。

1.2 实验动物及临床样本

BALB/c雌性小鼠（SPF），体质量为（20±2）g ，购自成都达硕实验动物有限公司；腹泻粪便来自四川省某肉山羊养殖场。

1.3 沙门氏菌的分离与鉴定

1.3.1 增菌。取1 g左右粪便样接种于BPW增菌液中，（36±1）℃下培养24 h。移取1 mL BPW增菌液转种于10 mL TTB增菌液中（42±1）℃培养24 h。

1.3.2 分离与纯化。培养后的TTB增菌液划线接种于SS培养基，（36±1） ℃培养24 h，从每个培养基上挑取3～5个圆形、有光泽、隆起、光滑的疑似菌落接种于SS培养基，进行纯培养。

1.3.3 沙门氏菌的鉴定。用A～F多价血清与分离菌株的纯培养进行玻板凝集试验，阳性菌株送至四川省疾病预防控制中心进行鉴定。

1.4 LD50的测定

将沙门氏菌分离株（swun3816）接种于TSB培养基，37 ℃培养18 h，采用比浊法测定细菌浓度，以西南民族大学动物医学实验室建立的回归方程计算各稀释度的菌落形成单位（CFU），用TSB将菌液进行10倍递增稀释，使其终浓度为102～108 CFU/mL。将35只小鼠随机分为7组，每组5只，于灌胃前3 h停止喂食和饮水，组①～⑦分别灌胃接种不同浓度的沙门氏菌，0.5 mL/只。灌胃后各组小鼠隔离饲养，自由采食和饮水，逐日观察并记录各组小鼠发病死亡情况，采用Bliss法计算 LD50。

1.5 感染模型的建立 根据LD50的测定结果选择感染剂量，通过灌胃途径接种沙门氏菌分离株，每次接种5只小鼠，建立感染小鼠模型，试验重复3次，以确保模型的稳定性。

1.6 病理组织学观察

沙门氏菌分离株灌胃接种18只小鼠，用于建立感染模型，分别于接种后6、12、24、48、72、96 h随机取出3只，无痛处死，分别摘取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠等器官，用4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片，HE染色并镜检，另选取3只小鼠灌胃等体积TSB，并于灌胃后6 h，采用与模型组相同的方法处死小鼠并采样制备石蜡切片，作为健康对照组。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定结果

从山羊腹泻粪便样本中分离沙门氏菌疑似菌落，纯培养物与沙门氏菌A～F多价血清的玻板凝集试验为阳性，分离菌株swun3816经四川省疾病预防控制中心血清学鉴定为肠炎沙门氏菌。

2.2 swun3816对小鼠的致病性

2.2.1 临床症状。7个剂量的swun3816经灌胃途径接种小鼠，均可引起不同程度发病和死亡。小鼠最早于感染后3 h开始出现临床症状，表现为被毛粗乱、蜷缩弓背、精神不振、两侧眼睛流出浆液性眼泪、眼周被毛濡湿（图1a）、步履蹒跚、呼吸急促等症状，并随着感染时间的延长而逐渐加重，8.5 h后开始出现死亡。

2.2.2 swun3816对小鼠的LD50。不同剂量swun3816对小鼠的致死情况见表1。

对表1中数据采用Bliss方法进行计算，得出swun3816对小鼠的LD50为155.6 CFU/只。

2.3 swun3816感染小鼠模型的建立

选择经灌胃途径给小鼠接种swun3816，接种量为5×103 CFU/只，发现小鼠在96 h内全部死亡，临床症状和大体病变与 “2.2.1” 相似，3次重复试验结果一致，说明感染模型成功建立且稳定。

2.4 大体病变

小鼠肺脏严重淤血，表面有大量出血斑（图1b）；脾脏淤血肿大，边缘钝圆，体积为正常小鼠的2～3倍（图1c）；肝脏淤血肿大，表面可见大量不规则的灰白色壞死灶（图1d）；肠道充盈，内容物多呈淡黄色黏液样。小肠淤血，其余肠段未见明显病变。对照组小鼠未见病变。

2.5 swun3816感染小鼠的病理组织学变化

2.5.1 肝脏。感染后12 h，肝细胞出现广泛性的空泡变性，空泡较小（图2a）；感染后24 h，肝细胞空泡变性更加严重，空泡变大变多（图2b）；感染后48 h，窦状隙充血（图2c），肝细胞索出现核溶解、消失的无核细胞结构；感染后72 h，出现少量散在、较小的、具有蓝染核碎片的凝固性坏死灶；感染后96 h，窦状隙严重充血，肝组织出现大面积岛状分布的凝固性坏死灶（图2d）。

2.5.2 肾脏。感染后12～96 h，肾小管上皮细胞肿胀，广泛空泡变性，肾小管管腔变小甚至消失（图3a），肾小管管腔内有均质浅红色染的管型，间质部分血管扩张充血（图3b）。

2.5.3 肺脏。感染后12～96 h，肺泡隔广泛增厚（图4a），扩张充血；感染后72 h，支气管管腔中出现含有少量炎性细胞的淡染蛋白渗出液（图4b）；感染后96 h，支气管出血。

2.5.4 脾脏。感染后12 h，脾脏出现团块状均质、粉染结构（图5a）；感染后72 h，脾髓红细胞数量明显增加（图5b）；感染后96 h，出现凝固性坏死灶（图5c）。

2.5.5 肠管。感染后24 h，回肠绒毛开始出现断裂脱落（图6a）；感染后72 h，十二指肠和空肠绒毛开始出现断裂脱落（图6b、图6c）；盲肠、结肠、直肠未见明显病变。

2.5.6 心脏。心肌轻微淤血，心肌纤维间隙内可见少量的红细胞。

3 讨论

沙门氏菌血清型众多，不同血清型以及不同菌株的毒力差异很大。Swearingen等[11]采用口服方法感染BALB/c小鼠，测定了不同宿主源的6个亚种17个血清型共计32株沙门氏菌对小鼠的致病性，结果仅有2株沙门氏菌可致死小鼠，其LD50分别为1.6×105 和4.5×105 CFU/只，而另外30株均未引起小鼠产生明显的临床症状。因此，在经肠道感染小鼠建立沙门氏菌的感染模型时，通常要给试验小鼠长时间大剂量口服的抗生素，以破坏肠道正常菌群，从而提高口服感染模型的成功率[12-13]。该研究中羊源肠炎沙门氏菌swun3816经口服途径感染，可致死未经抗菌素处理小鼠，其LD50为155.6 CFU/只，可见该菌株具有很强的毒力，说明该菌株具有很强的侵袭力，能迅速突破肠道菌群的屏障，在宿主体内繁殖并向全身扩散蔓延，进而引起致死性疾病。该菌株是否存在较为独特的突破肠道防御屏障的侵袭性因子或毒力因子，有待进一步研究。

沙门氏菌可自然感染各种年龄段的人和动物，出现多种不同的临床症状，主要表现为伤寒、副伤寒、胃肠炎、腹泻和败血症，也可引起全身性感染，导致严重的综合征[2，14-15]。swun3816经消化道感染引起小鼠出现精神沉郁、呼吸困难、流泪和死亡，感染导致小鼠主要组织器官出现肿大、坏死、细胞空泡变性、炎性细胞浸润等病变，说明该菌株经消化道感染可引起小鼠的全身性感染，其主要症状与病理变化与国内的相关研究结果一致[16-20]。swun3816经口服途径感染致小鼠出现眼炎，研究显示沙门氏菌感染可引起家禽结膜炎或者失明[21-23]，但未见肠炎沙门氏菌引起小鼠眼炎的报道，其原因有待进一步研究。

肉眼或镜下观察出现病理变化的组织器官，通常是细菌的定植和入侵门户[16-17，24-27]。沙门氏菌黏附到肠道黏膜后的内化途径有2条：一条是通过巨胞饮的作用，侵袭动物肠黏膜淋巴结集结的淋巴上皮中的特殊抗原捕获细胞——M细胞，通过M细胞进入黏膜下层组织；另一条是直接侵袭M细胞周围的肠上皮细胞，通过上皮细胞进入黏膜下层组织[1]。肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌在进入消化道后，會在小肠和结肠繁殖并侵入黏膜下层组织[28-29]，牦牛源御成门沙门氏菌的入侵门户为回肠[20]。该研究中羊源肠炎沙门氏菌经口进入消化道，能引起小肠粘膜淤血，十二指肠、空肠和回肠上皮细胞坏死，崩解，肠绒毛断裂，因此这些部位可能就是其内化并向全身其他器官扩散蔓延的入侵门户。

4 结论

山羊源肠炎沙门氏菌swun3816致病性强，经口服途径接种可引起小鼠全身性感染，小肠是swun3816的入侵门户。

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