HPLC法测定黑木耳中腺苷及尿苷含量

郑雪 郑春英 吴桐

摘要 [目的]建立简单、快速同时分析黑木耳中腺苷及尿苷含量的HPLC法。[方法]采用Venusil XBP C18色谱柱，流动相为甲醇-水（15：85），流速为1 mL/min，检测波长为260 nm，柱温为室温。[结果]腺苷及尿苷的线性范围分别为0.02～0.10 mg/mL（r=0.999 9）和0.04～0.20 mg/mL（r=0.999 9），平均加样回收率分别为99.58%（RSD=0.78%）、98.99%（RSD=1.21%）。[结论]该方法简单、快速、准确、重现性好、回收率高，可用于黑木耳中腺苷及尿苷含量的测定，其结果可为其质量控制提供参考。

关键词 HPLC；黑木耳； 腺苷； 尿苷

中图分类号 TS207；R931 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）32-0173-02

Determination of Adenosine and Uridine in Auricularia auricula by HPLC

ZHENG Xue1，2，ZHENG Chunying1，2，WU Tong1，3 （1.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology，Ministry of Education，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150500；2.Key Laboratory of Microbiology，College of Heilongjiang Province，School of Life Sciences，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150080；3.Key Laboratory of Molecular Biology，College of Heilongjiang Province，School of Life Sciences，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150080）

Abstract [Objective] To develop a HPLC method for simultaneous determination of adenosine and uridine in Auricularia auricular.[Method]The HPLC system consisted of a Venusil XBP C18 column with the mobile phase of methanol-water （15∶85） at a flow rate of 1.0 mL/min.UV detector was used，and the detection wavelength was 260 nm.The column temperature was room temperature.[Result]The liner range of adenosine and uridine were 0.02-0.10 mg/mL（r=0.999 9）and 0.04-0.20 mg/mL（r=0.999 9），respectively.The average recoveries were 99.58%（RSD=0.78%） and 98.99%（RSD=1.21%），respectively.[Conclusion] The method is accurate，simple，rapid and reproducible for determination of adenosine and uridine in Auricularia auricular.The determination results can be used as a reference for the quality control for Auricularia auricular.

Key words HPLC；Auricularia auricular；Adenosine； Uridine

作者简介 郑雪（1994—），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：微生物制药。*通讯作者，郑春英，教授，博士，硕士生导师，从事微生物制药研究；吴桐，讲师，从事寒区植物基因与生物发酵研究。

收稿日期 2018-09-06

黑木耳（Auricularia auricula）是我国珍贵的食药用真菌，具有抗肿瘤[1]、抗凝血[2]、抗氧化[3]、降血脂[4]、免疫调节[5]等作用。黑木耳中含有多糖[6]、腺苷、尿苷[7]、黄酮[8]等多种活性成分，深受消费者喜爱。关于黑木耳的质量控制方法目前主要有2種，一是针对黑木耳活性成分黑木耳多糖，采用分光光度法[9]进行黑木耳中总多糖的含量测定；此方法操作复杂，需要用到浓硫酸等腐蚀性较大的试剂，且多糖不易长时间存放，测定结果容易受到温度、时间等多种因素的影响。二是针对黑木耳中的总黄酮成分，采用比色法进行测定[10]，此法简单粗糙、干扰因素多、结果不可靠。HPLC法具有快速、高效、准确度高、应用范围广等优点，笔者采用HPLC法，以黑木耳中主要活性成分尿苷及腺苷为指标，建立黑木耳中尿苷及腺苷的含量测定方法，为黑木耳的质量控制研究提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 不同产地黑木耳样品均购于哈尔滨市家乐福超市，样品现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室。腺苷对照品（中国药品生物制品检定所）；尿苷对照品（中国药品生物制品检定所）；甲醇为色谱纯。

1.2 仪器与设备

FL2200高效液相色谱仪（浙江温岭福立分析仪器有限公司）；KQ100-DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（METTLER TOLEDO，美国）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件。儀器为FL2200，色谱柱为Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（15∶85），流速为1 mL/min，检测波长为260 nm，柱温为室温，进样量为10 μL。

1.3.2 供试品溶液的制备。精密称取黑木耳粉（40目）10 g，加入400 mL 50%甲醇（V/V）溶液，超声提取2次，每次60 min，离心、过滤，取上清减压蒸发至近干，再以50%甲醇（V/V）定容至25 mL，0.45 μm的微孔滤膜滤过后作为供试品溶液。

1.3.3 线性关系考察。分别精密称取腺苷和尿苷对照品适量，以50%甲醇（V/V）配制成腺苷、尿苷质量浓度分别为0.1、0.2 mg/mL的混合对照品储备液；精密吸取混合对照品储备液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别置于2 mL容量瓶中，以50%甲醇（V/V）定容，摇匀，得到系列腺苷、尿苷混合对照品溶液。分别吸取此系列混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以各物质质量浓度（mg/mL）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

1.3.4 方法学考察。在黑木耳样品中选一个样品，连续进样6次，每次10 μL，测定仪器进样精密度；所选取的样品溶液分别在0、2、4、6、8、12 h进样10 μL测定其峰面积，考察样品的日内稳定性，同时，取上述样品溶液在配制6 d内每日进样，测定各组分的峰面积积分值，考察样品的日间稳定性；取同一黑木耳样品6份，平行制备样品溶液并测定该方法的重现性；精密称取同一已知含量的黑木耳样品，共6份，精密加入一定量的尿苷、腺苷对照品，按“1.3.2”供试液制备方法制备样品，在“1.3.1”色谱条件下进样10 μL，计算的回收率。

1.3.5 颗粒度对提取率的影响。分别准确称取20、40、60、80目黑木耳粉各10 g，以料液比1∶40的50%甲醇超声提取2次，每次60 min，测定腺苷、尿苷含量。

1.3.6 料液比对提取率的影响。准确称取黑木耳粉（40目）10 g，以50%甲醇超声提取2次，每次60 min，分别在料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的条件下提取黑木耳样品，检测腺苷、尿苷含量。

1.3.7 样品测定。分别取不同产地黑木耳样品粉末，按“1.3.2”项下平行制备3份供试品液，按“1.3.1”项下条件测定。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

2.2 方法学考察

2.3 颗粒度对提取率的影响

黑木耳具有胶质含量高、黏度大、吸水性强等特点，因此该研究比较了黑木耳样品颗粒度对提取率的影响，其结果见图1。从图1可以看出，随黑木耳样品颗粒度的减小，黑木耳中腺苷及尿苷的提取率先增大再降低。当颗粒度过小时，可能是由于黑木耳样品颗粒太细，部分样品漂附在提取溶剂表面，导致提取率出现波动现象。当黑木耳颗粒度为40目时（n=6），腺苷和尿苷均有最大提取率。

2.4 料液比对提取率的影响

黑木耳样品的强吸水性导致提取溶剂消耗量较大，为保证提取完全，在此考察了料液比对提取率的影响，结果见图2。从图2可以看出，料液比由1∶20 扩大到1∶40时，腺苷和尿苷的提取率都有所上升，当料液比继续扩大时，提取率变化不大。因此从节约成本考虑，料液比以1∶40为宜。

2.5 样品测定结果 采用HPLC法测定黑龙江省不同产地黑木耳样品中腺苷及尿苷含量，其结果见图3及表3。

3可以看出，不同产地黑木耳样品中腺苷及尿苷含量不同，其中哈尔滨生产的黑木耳样品中腺苷含量最高（0.153 6 mg/g），海林生产的黑木耳样品中尿苷含量最高（0.817 4 mg/g）。

3 结论

HPLC法具有分离效能高、分析速度快等优点，近年来已普遍应用于食品、药品中活性成分的定量分析。

该研究首次采用HPLC法测定黑木耳中腺苷和尿苷的含量，并对6种不同生产产地的黑木耳样品进行分析，试验结果表明，该方法操作简便、结果可靠、重现性好，可以准确测定黑木耳中腺苷及尿苷的含量，能够为黑木耳的质量控制提供参考。

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