高通量测序技术研究鱼腥草酵素对小鼠肠道菌群的影响

赵菲 刘孝余 宫芳婧等

摘要 [目的]采用高通量测序技术分析鱼腥草酵素对昆明雄性小鼠肠道菌群的影响。[方法]连续灌胃20 d后，收集小鼠粪便，采用高通量测序技术对各组小鼠粪便菌群进行分析。[结果]鱼腥草酵素组（C）小鼠肠道菌群物种多样性最高，生理盐水组最低；另外，小鼠肠道中有益菌与致病菌比例在各组之间差异显著，鱼腥草酵素组中有益菌群的比例均大于生理盐水组和水果酵素组，而致病菌比例最高的为水果酵素组（56.36 %）。[结论]鱼腥草酵素对小鼠的肠道菌群具有调节作用。

关键词 鱼腥草酵素；小鼠；肠道菌群；高通量测序

中图分类号 R151 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）32-0156-04

Effect of Houttuynia cordata Enzyme on Intestinal Flora in Mice Evaluated by Highthroughput Sequencing

ZHAO Fei，LIU Xiaoyu，GONG Fangjing et al （College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023 ）

Abstract [Objective]Highthroughput sequencing technology was used to analyze the effect of Houttuynia cordata enzyme on intestinal microflora in Kunming male mice.[Method]Thirty mice were randomly divided into three groups：saline group （B），fruit enzyme group （S），and Houttuynia cordata enzyme group （C）.After 20 days of continuous gavage，the feces of the mice were collected and the fecal microbiota of each group were analyzed by highthroughput sequencing.[Result]The results showed that the species diversity of the intestinal flora in the Houttuynia cordata enzyme group （C） was the highest，and that of the saline group was the lowest.In addition，the ratio of beneficial bacteria and pathogenic bacteria in the intestinal tract of the mice varied significantly among the groups.The proportion of beneficial bacteria in the grass enzyme group was greater than that in the saline group and the fruit enzyme group，and the highest proportion of pathogenic bacteria was in the fruit enzyme group （56.36 %）.[Conclusion]Houttuynia cordata enzyme modulates the intestinal flora of mice.

Key words Houttuynia cordata enzyme；Mice；Intestinal flora；Highthroughput sequencing

作者簡介 赵菲（1985—），女，山东邹平人，博士，讲师，从事食品营养研究。*通讯作者，博士，教授，从事食品科学研究。

收稿日期 2018-06-25；修回日期 2018-09-21

鱼腥草是三白草科蕺菜属植物蕺菜（Houttuynia cordata Thunb）的全草，《本草纲目》载：“其叶腥味，故俗称鱼腥草”。其别名多因地而异，如侧耳根、鸡儿根、臭灵丹、臭荞麦等[1]。鱼腥草还含有大量的对身体有益的活性物质，如鱼腥草素、多糖、黄酮类化合物等[2-3]。鱼腥草具有清热排毒、利尿通淋等功能[4]，已被国家卫生健康委员会（原卫生部）正式确定为“既是药品，又是食品”的资源之一，现已受到越来越多的关注。鱼腥草酵素和水果酵素均为益生菌发酵后的产品[5-6]。益生菌发酵对肠道菌群的多样性具有显著影响，在其他研究领域已经被系统论证，而有关鱼腥草酵素和水果酵素对肠道菌群的影响目前尚不清楚。

肠道中微生物的生长繁殖和变化与粪便中菌群的组成关系密切，因此，通过对粪便中菌群多样性构成的研究可以有助于人们了解肠道菌群的变化规律[7]。近些年来，在微生物菌群分析中，更多的是采用分子生物学技术进行菌落分析，相对而言，高通量测序技术对于肠道菌群的组成分析具有准确定量、定时检测的优势。通过高通量测序技术的应用，有助于对肠道菌群组成进行较全面的研究[8-9]。

笔者通过研究生理盐水（B）、水果酵素（S）、鱼腥草酵素（C）灌胃小鼠后，对小鼠肠道菌群进行高通量测序，探讨鱼腥草酵素对小鼠肠道菌群微生物多样性的影响，即采用高通量测序技术对小鼠粪便菌群16S rRNA 的V4 区域进行测序，再与silva数据库中的基因序列进行比对，得到样品中所含有的微生物种类及丰度；分析鱼腥草酵素（C）灌胃的小鼠粪便菌群的结构及多样性，再与生理盐水（B）和水果酵素（S）灌胃小鼠的粪便菌群进行比较，以全面了解鱼腥草酵素对小鼠肠道菌群的影响，旨在为人类健康饮食提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级昆明小鼠，30只，雄性（20±2）g，采购于大连医科大学动物实验中心。实验小鼠饲养于遮光室内的鼠笼中，室温（25±3） ℃，相对湿度40%～60%，自由饮水和取食。小鼠饲料购置于大连医科大学动物实验中心。实验动物许可证号 SYXK（辽）2008-0002。

1.2 方法

1.2.1 鱼腥草酵素的制作。将苹果、梨、木瓜、胡萝卜、山药、冬瓜、辣椒、大白菜、萝卜、桔梗洗净并沥干，切成1～3 cm见方的块状；将大枣、蓝莓、黑果花楸、黑加仑、山葡萄、木耳、枸杞子及沙棘洗净并沥干；各取相同质量进行混合，得混合物A；将混合物A与食醋、红糖、鱼腥草按质量比15.0∶1.0∶0.5∶0.5进行混合，得混合物B，再将烧酒曲、酵母、乳酸菌及醋酸菌加入混合物B中，于发酵罐中10～25 ℃发酵50 d，得一次发酵液；所述烧酒曲、酵母、乳酸菌及醋酸菌的加入量为混合物B质量的0.5%～1.0%、1.0%～2.5%、1.0%～1.5%、1.0%～1.5%，所述烧酒曲、酵母、乳酸菌及醋酸菌的菌数为（15～26）×106个/ml。将一次发酵液置于发酵罐中，所述一次发酵液体积为发酵罐容积的2/3，发酵罐保持36～38 ℃恒温发酵至少60 d，发酵的同时于发酵罐底向发酵罐内通入空气，1 m3发酵罐空气通入量为0.5～1.0 L/min，即得鱼腥草发酵液；将所得鱼腥草发酵液过滤，滤液放入罐中浸泡竹炭贮藏30 d，即得鱼腥草酵素。

1.2.2 小鼠糞便的收集。

将30只昆明小鼠随机分成3组，每天9：00～11：00分别采用生理盐水（B）、鱼腥草酵素（C）、水果酵素（S）对各组进行灌胃，灌胃量为0.2 mL/10 g，连续20 d。最后一次灌胃24 h后，采用拎尾法收集各组粪便于干燥无菌的离心管中，后立即放于液氮中速冻。

1.2.3 DNA的提取及测序。

将速冻的小鼠粪便采用干冰送样方法寄送至深圳华大基因科技服务有限公司武汉分公司，针对样品16S rRNA基因V4区采用V4通用引物进行PCR扩增及测序。采用窗口去质量的方法去除接头污染reads、含N的reads、低复杂大的reads，样品通过barcode合并建库后，采用barcode将样品拆分后，对样品物种组成和丰度进行分析，即OTU及其丰度分析（OTU聚类、OTU韦恩、OTU PCA分析、OTU Rank曲线）、物种及其丰度分析；样品复杂度分析，即单个样品复杂度（Alpha多样性、Alpha多样性稀释曲线图、Alpha多样性合性图）、样品间复杂度比较分析（Beta分析等）、样品组间显著性差异因子、LEFSe组间群落差异分析；16S测序样品功能预测和差异性分析。

2 结果与分析

2.1 菌群多样性

利用Mothur软件对每个样品的OTU数量（相似水平97%以上）进行计算，OTU数量可以代表样品物种的丰度[10]。由表1可知，在所有样品中，样品OTU数量最多的为鱼腥草酵素C3组（446），最少的为生理盐水B3组（389），这表明小鼠粪便中菌群丰度存在差异。其中，样品中菌群多样性指数最高的为鱼腥草酵素C2组（ACE值472.003 6 和Chao值471.794 1最高），最低的为生理盐水B3组（ACE值408.633 0和Chao值406.531 3最低）。同时，Alpha多样性分析也表明，给小鼠灌胃鱼腥草酵素后，其肠道菌群的多样性高于水果酵素组和生理盐水对照组，且鱼腥草酵素组的粪便菌群丰度最高。Shannon指数越大，表示群落多样性越高，9组样品中以鱼腥草酵素组C3的Shannon值最大（4.612 270），水果酵素组S2次之。Simpson值越低表示群落多样性越高，鱼腥草酵素组C3的Simpson值在9组样品中最小（0.019 000），其次为水果酵素组S2的Simpson值，为0.026 708。Coverage指数是样品的测序深度也表明样品的覆盖率，9个样品的Coverage指数均在0.89以上，表明样品中序列未被检测到的可能性较低。各组样品粪便菌群的OTU数量及Alpha多样性说明，3个鱼腥草酵素组小鼠粪便的菌群多样性最高，鱼腥草酵素对小鼠的肠道菌群具有一定的调整作用，且作用效果最为突出。

2.2 菌群构成

通过与数据库进行比对，对OTU进行物种分类并分别在门、纲、目、科、属几个分类等级上对各个样品作柱状图分析。

由图1可见，肠道微生物种类繁多，健康的肠道中微生物从门的水平上可分为6大类：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia） ，其中90%以上由厚壁菌门和拟杆菌门构成[11]。从该试验的粪便微生物群落结构上看，鱼腥草酵素组（C）和水果酵素组（S）小鼠的粪便菌群与生理盐水组（B）有显著差异。在门的水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）在鱼腥草酵素组（C）小鼠粪便菌群中的相对比例最高（63.86%），在水果酵素组（53.20%）、生理盐水组（39.64%）中拟杆菌门在小鼠粪便菌群中的相对比例均低于鱼腥草酵素组。小鼠肠道中的拟杆菌门（Bacteroidetes）主要为拟杆菌纲（Bacteroidia），拟杆菌门（Bacteroidetes）是肠道内第二大优势类群，参与肠道内糖类、脂类的代谢，对宿主健康有很重要的影响，鱼腥草酵素组的拟杆菌门（Bacteroidetes）的显著增加，提示肠道中物质代谢存在一定程度的优化；厚壁菌门（Firmicutes）在鱼腥草酵素组（C）中的相对比例达到28.31%，与其他2组差异不显著。厚壁菌门（Firmicutes）在肠道中能够帮助多糖发酵，厚壁菌门包括芽孢杆菌纲（芽孢杆菌目和乳杆菌目），其中芽孢杆菌属的主要作用是维持动物肠道的健康[12]。该试验中小鼠粪便中的第二大优势菌就是厚壁菌门（Firmicutes），表明鱼腥草酵素能够参与糖类代谢，保持肠道菌群健康。而变形菌门（Proteobacteria）在鱼腥草酵素组（5.40%）小鼠粪便菌群中占比最低，其他2组中变形菌门的比例高于鱼腥草酵素组。变形菌门（Proteobacteria）是细菌中最大的一门，包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌等病原菌，这类细菌易引起动物腹泻[13]。该研究中鱼腥草酵素组变形菌门的大量减少，提示肠道中存在的炎症状态有所改善。

由图2可见，在纲的水平上，生理盐水组中梭菌纲（Clostridia）、幽门螺杆菌纲（Epsilonproteobacteria）、脱铁杆菌纲（Deferribacteres）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、δ变形菌纲（Deltaproteobacteria）的相对丰度比例最高，鱼腥草酵素组比例最低。试验结果表明，鱼腥草酵素明显降低了小鼠肠道内致病菌的含量，改善了肠道菌群，而拟杆菌纲（Bacteroidia）的比例在生理盐水组最低，鱼腥草酵素组中拟杆菌纲（Bacteroidia）比例最高，表明拟杆菌纲作为第一优势菌参与肠道内糖类、脂类的代谢，鱼腥草酵素有效地改善了小鼠肠道的菌群组成。

由图3可见，在目的水平上，生理盐水组中梭菌目（Clostridiales）、弯曲杆菌目（Campylobacterales）、乳杆菌目（Lactobacillales）、脱铁杆菌目（Deferribacterales）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）的比例最高，鱼腥草酵素组中比例最低，且水果酵素和鱼腥草酵素组中弯曲杆菌目（Campylobacterales）、乳杆菌目（Lactobacillales）和脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）比例下降明显，表明酵素组能够选择性地抑制有害菌的生长，并使肠道菌群的比例得到优化，其中，以鱼腥草酵素效果尤为明显。而拟杆菌目（Bacteroidales）在生理盐水组中比例最低，在鱼腥草酵素组中比例最高，拟杆菌目（Bacteroidales）在鱼腥草酵素组小鼠肠道中比例增加，表明鱼腥草酵素能有效改善肠道菌群组成，使有益菌含量增加显著。

如图4所示，在科的水平上，生理盐水组（B）、水果酵素组（S）和鱼腥草酵素组（C）中物种组成相似度较高，其中拟杆菌科S24_7、幽门螺杆菌科（Helicobacteraceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）丰度差距较大，且在生理盐水组中丰度最高，鱼腥草酵素中丰度最低且呈下降趋势。试验结果表明，肠道微生物菌群中杆菌出现下降趋势，而其他肠道共生菌则呈现上升趋势，表明水果酵素和鱼腥草酵素均能改善肠道菌群组成，降低有害菌比例，且以鱼腥草酵素效果显著。除此之外，在水果酵素组和鱼腥草酵素组检测出产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、类杆菌科（Bacteroidaceae）、脱铁杆菌科（Deferribacteraceae）、韦荣球菌科（Veillonellaceae），而生理盐水组中并未检出上述菌科，且在鱼腥草酵素组中上述菌科丰度均低于水果酵素组，呈下降趋势。试验结果表明，酵素灌胃组增加了肠道菌群的多样性，而上述菌群均为致病菌，鱼腥草酵素组中上述致病菌含量减低，表明鱼腥草酵素安全性更高，其中，少量韦荣球菌属对人体有益无害，不仅能够增强人呼吸系统与消化系统的免疫力，还能将一种与牙齿相接触的酸性物质变为弱酸性[14]。此外，在生理盐水组和水果酵素组检测出的Odoribacteraceae科，在鱼腥草酵素组中并未检出，这也表明鱼腥草酵素确实改善了小鼠肠道菌群的组成，且效果明显。

由图5所示，从属的水平上看，占比最高的是螺杆菌属（Helicobacter），生理盐水组（B）中螺杆菌属（Helicobacter）丰度最高，达到15.48%，鱼腥草酵素组中螺杆菌属（Helicobacter）丰度最低，为2.55%，下降比例明显，螺杆菌属为已经明确的致病菌，鱼腥草酵素组中螺杆菌属丰度降低，表明鱼腥草酵素能够抑制致病菌的生长繁殖。第二大占比最高的菌是普氏菌属（Prevotella），在鱼腥草酵素中丰度最高（18.35%），在水果酵素中豐度最低（10.59%），而生理盐水组居中（14.16%），普氏菌属在肠道菌群中的变化，表明鱼腥草酵素的灌胃使小鼠肠道菌群中有益菌的含量得到改善，成为第二大优势菌。乳酸菌属、Mucispirillum属、颤螺菌属（Oscillospira）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）在鱼腥草酵素组中丰度最低，在生理盐水组中丰度最高，表明鱼腥草酵素能有效抑制有害菌的生长，除此之外，在生理盐水组中检测出Dorea属，而水果酵素和鱼腥草酵素组中并未检测出；在水果酵素组中检测出脱硫弧菌（Desulfovibrio），而生理盐水组和鱼腥草酵素组并未检测出；在鱼腥草酵素组和水果酵素组均检测出考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和萨特氏菌属（Sutterella），且在水果酵素组中考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和萨特氏菌属（Sutterella）丰度比鱼腥草酵素组高，而生理盐水组中并未检测出该菌属。试验结果表明，水果酵素和鱼腥草酵素均改变了小鼠肠道菌群的组成，丰富了肠道菌群，以鱼腥草酵素效果显著。

2.3 样品进化树

根据已知的参考数据库中的亲缘关系，利用LEfSe软件对得到的OTUs 构建进化树，见图6。

由图6可见，在鱼腥草酵素组（C）中，可以看到S24_7（拟杆菌科）、拟杆菌纲（Bacteroidia）和拟杆菌门（bacteroidia）在酵素中起重要作用，且丰度较高。从水果酵素组（S）中可以看到，韦荣球菌科（Veillonellaceae）、产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、伯克氏菌目（Burkholderiales）作用明显，其中伯克氏菌目（Burkholderiales）为β-变形菌纲的一个目。在生理盐水灌胃组（B组）中可以看出，幽门螺杆菌（Helicobacteraceae）、弯曲杆菌目（Campylobacterales）、变形菌纲（Beltaproteobacteria）在肠道中起主要作用。从样品聚类树可以看出，不同灌胃组小鼠肠道菌群中起主要作用的微生物菌群不同，在鱼腥草酵素组中拟杆菌门是其主要作用菌群，且为优势菌群，对调节肠道菌群组成起到重要作用。而水果酵素灌胃组的肠道菌群中以变形菌门等细菌为主要作用菌群，也说明水果酵素没有改善肠道菌群组成。在生理盐水灌胃组中可以看出，弯曲杆菌和幽门螺杆菌及变形菌这些有害菌在肠道中起到主要作用，综上所述，鱼腥草酵素能够显著改善小鼠肠道菌群组成，抑制有害菌生长，并有益于优势肠道菌群的繁殖。

3 结论与讨论

肠道菌群是人体重要组成部分，肠道菌群失衡会引起人体相关功能紊乱，如可以提高急慢性疾病的发病率[15]。该研究所采用的高通量测序技术是目前应用于肠道微生物研究的前沿技术，也是一种新型测序技术[16]。粪便菌群的变化能够明确反映出肠道菌群的健康状态，笔者通过Illumina高通量测序技术研究生理盐水灌胃组（B）、水果酵素组（S）、鱼腥草酵素组（C）对小鼠粪便菌群多样性的影响，分析其粪便菌群变化，结果显示不同灌胃组小鼠肠道菌群丰度存在较大差异，且不同菌群的变化具有一定的规律性[17-18]。

在门的水平上分析，鱼腥草酵素可以有效增加拟杆菌门（Bacteroidetes）的含量，减少肠道中的变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和脱铁杆菌门（Deferribacteres） 的含量。在目的水平上分析，鱼腥草酵素可以有效提升拟杆菌目（Bacteroidales）的含量，减少肠道中弯曲杆菌目（Campylobacterales）和乳杆菌目（Lactobacillales）、脱铁杆菌目（Deferribacterales）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）的含量，且效果显著。在纲的水平上分析，鱼腥草酵素可以提升拟杆菌纲

（Bacteroidia）的含量，减少肠道中的梭菌纲（Epsilonproteobacteria）、幽门螺杆菌纲（Epsilonproteobacteria）、脱铁杆菌纲（Deferribacteres）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、δ变形菌纲（Deltaproteobacteria）的含量。在属的水平上分析，鱼腥草酵素可以有效减少拟杆菌属（Bacteroides）、螺杆菌属（Helicobacter）、乳酸菌属（Lactobacillus）、Mucispirillum属、颤螺菌属（Oscillospira）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）的含量，增加普氏菌属（Prevotella）的含量，且效果都比水果酵素好。

粪便菌群多样性分析表明，鱼腥草酵素组（C）小鼠粪便菌群多样性最高，生理盐水灌胃组（B）最低，水果酵素组（S）居中。说明鱼腥草酵素的使用调整了小鼠肠道微生态的动态平衡，增加了菌群的数量。根据试验中各组小鼠肠道中菌群含量变化的差异可知，鱼腥草酵素组能够提高小鼠肠道菌群的丰度，在一定程度上可促进有益菌群数量的增加，并抑制致病菌的繁殖。因此，摄入适量的鱼腥草酵素对调节肠道菌群的平衡具有一定的帮助。

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