低温胁迫下烟苗多酚代谢及其抗氧化能力分析

周培禄 刘光亮 王树声 李琦瑶 许娜 王程栋 杨银菊 曾文龙 陈爱国

摘 要：为了明确在低温胁迫条件下烟苗中多酚物质代谢与抗氧化能力的关系，本研究以烟草K326为材料，对比分析了低温胁迫处理（4 ℃）和对照处理（25 ℃）烟苗叶片中多酚物质含量及其代谢酶活性和基因表达水平变化与植物抗氧化酶活性的关系。结果表明，低温胁迫处理后，烟草叶片萎蔫、细胞膜损伤严重，相对电导率升高；总酚含量受低温胁迫影响较小，木质素含量显著增加（p<0.05）；低温处理后，SOD活性显著升高（p<0.05），CAT活性和总抗氧化能力（T-AOC）均低于对照；PAL、HCT和POD酶活性均升高，PAL、HCT和POD基因表达水平均上调。以上结果表明，低温胁迫促进烟苗多酚代谢中木质素合成，通过提高木质素含量增强细胞壁的保护作用是植物抵御环境胁迫的重要机制。

关键词：烟草；低温胁迫；木质素；多酚代谢；抗氧化能力

中图分类号：S572.01 文章编号：1007-5119（2018）05-0033-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.005

Abstract： In order to study the relationship between metabolism of polyphenols and the antioxidant capacity of tobacco seedlings under cold stress， 7th-leaf stage tobacco seedlings of K326 were used to measure the physiological indicators of tobacco seedlings at chilling stress （4 ℃）， the changes of polyphenol contents， metabolism related enzyme activities， and gene expression were detected during the stresses of chilling. The results showed that after the treatment of chilling stress， leaf wilting， cell membrane damage and relative electrolytic leakage of tobacco increased， while total polyphenol content was less affected by low temperature stress， and lignin content increased significantly （p<0.05）. The activity of superoxide dismutase （SOD） was significantly increased （p<0.05）， the activity of catalase （CAT） and total antioxidant capacity （T-AOC） decreased and lower than control treatment. PAL， HCT and POD enzyme activities were increased and the expression levels of PAL， HCT and POD genes were all increased under chilling stress. The above results indicated that the metabolism of polyphenols shifted to the downstream biosynthesis of lignin， and enhancing the hardness of cell walls by increasing lignin content might be an important factor for plants to improve their cold resistance.

Keywords： tobacco； cold stress； lignin； polyphenol metabolism； antioxidant capacity

低温冷害是作物栽培中常常遇到的一种自然灾害，是很多地区限制农业生产的重要因素[1]。在我国南方烟区早春季节常会受“倒春寒”的危害[2-3]，严重影响烟叶产量和质量[4]。前人研究表明，低温胁迫植物诱导活性氧（ROS）的积累，破坏重要细胞化合物如DNA和RNA结构，造成蛋白质氧化和膜脂过氧化，最终导致细胞死亡[5]。早期研究认为，在遭受低温、光照辐射等胁迫时植物通过增加合成抗氧化酶——超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等清除过多ROS[6-7]，从而保护细胞的正常功能。

研究表明多酚物质合成是植物应对环境胁迫的另一重要的途径[8]。酚类化合物在植物中广泛存在，主要来源于苯丙烷代谢途径[9]。植物一方面通过调控酚类化合物的含量与组成抑制氧自由基的产生，保护光系统及细胞膜完整性[10-11]，同时通过改变木质素的含量和组成结构提高细胞壁强度[12]，增强植物低温耐性[13]。低温条件下，通过专一性酶抑制剂抑制ROS的产生，多酚合成关键酶苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、肉桂酸羟化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-Coumarate：coenzyme A ligase，4CL）活性和基因表達量降低，多酚含量降低，而通过ROS激活剂处理则得出相反的结果[14]，从而推测植物体内ROS作为信号分子响应环境胁迫促进酚类化合物的合成[15]。

本实验选用对低温敏感且在我国广泛种植的烤烟品种K326为试验材料，应用人工智能气候箱进行低温胁迫处理，通过对相关指标的测定，分析烟苗在低温胁迫下多酚物质代谢变化与植物抗氧化能力的关系，了解多酚物质在植物抵御环境胁迫中的关键作用，以推进增强烟草幼苗低温耐性的研究，为提高烟叶产量与质量及解决烟苗低温伤害难题提供重要的理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料和低温处理

烟草（Nicotiana tabacum， cv. K326）幼苗在人工智能气候箱（DPGX-350B，宁波普朗特仪器有限公司，浙江）培养至7叶，培养条件为温度：（25±2） ℃，相对湿度65%～75%，光照周期时间为14 h照光/10 h黑暗。然后分别在25 ℃（CK）和4 ℃（T）条件下分别培养，0、6、12、18、24和36 h后取倒数第2片展开叶作为后续试验材料，取样3株混匀作为一个样品，共3个重复。取样后样品迅速用液氮处理后放于?80 ℃冰箱保存备用。

1.2 总酚和木质素含量测定

多酚含量检测：取2 g鲜样（粉碎），浸泡在10 mL 含70%乙醇、1%盐酸（体积分数）的溶液中2 h，然后4 ℃条件离心20 min（10 000×g），取上清液稀释至25 mL备用。总酚含量用Folin-Ciocalteu（福林-西奥卡特）法测定[16]。木质素含量根据木质素含量测定试剂盒（Cominbio， suzhou， China）方法进行检测。

1.3 相对电导率和MDA含量测定

相对电导率（REC）测定根据YANG等[17]和WAHID等[18]方法。10片新鲜叶圆片（0.5 cm2）置于烧杯加入20 mL蒸馏水并抽真空30 min，震荡3 h后测定初试电导率（S1）。然后将有叶圆片和蒸馏水的烧杯煮沸30 min，冷却至室温后测定最终电导率（S2）。以蒸馏水作为对照测定电导率（S0）。相对电导率（REC）的计算是样品被高温杀死前后电导率的百分比，表示为：REC（%）=[（S1-S0）/（S2-S0）]×100。丙二醛（MDA）含量测定根据CUI等[19]的方法。

1.4 抗氧化体系检测

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定根据NBT法测定[20]。过氧化物酶（POD）活性通过测定愈创木酚因氧化反应引起在470 nm处吸光度的变化[21]。过氧化氢酶（CAT）活性测定参照文献[22]。总抗氧化能力（T-AOC）测定根据南京建成生物工程研究所购买的试剂盒说明书方法，单位为U/g鲜质量。

1.5 多酚代谢关键酶活性测定

采用紫外分光光度法利用PAL活性测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性。采用HCT活性测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定莽草酸酯羟基肉桂酸转移酶（Shikimate O-hydroxycinnamoyl transferase，HCT）活性，采用POD活性测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性。

1.6 引物设计及表达量测定

根据qRT-PCR引物设计的要求，采用Primer

5.0软件进行引物设计（表1）。以Actin为内参基因[23]，采用2-ΔΔCT法进行基因相对定量分析[24]。

1.7 数据处理

采用SPASS 20软件进行LSD多重比较法方差分析（p<0.05），Microsoft Excel 2013制作图表。

2 结 果

2.1 低温胁迫对烟苗形态和相对电导率的影响

为了探究低温胁迫对烟苗生长发育的影响，比较了4 ℃（T）低温处理和25 ℃（CK）对照处理形态学差异变化。结果表明（图1），一定时间的低温胁迫会引起烟苗叶片的萎蔫，萎蔫程度随着胁迫时间的增加而加强。另外，相对电导率（REC）测定结果表明（图2），低温处理后叶片REC升高，并在12 h开始低温处理与对照之间差异达到显著水平（p<0.05），在24 h时达到最高值。

2.2 低温胁迫对烟苗抗氧化能力的影响

由图3可知，低温胁迫处理后烟苗叶片中超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高，胁迫6 h时差异达到显著水平（p<0.05），持续低温胁迫处理，SOD活性维持在相对较高的水平。过氧化氢酶（CAT）活性和总抗氧化能力（T-AOC）在低温胁迫处理后下降，并在12 h降至最低值，继续低温胁迫则表现出上升的趋势，但仍低于对照处理。

2.3 低温胁迫对烟苗总酚和木质素含量的影响

由图4可知，烟苗叶片中总酚含量在低温处理后下降，但无显著的差异。在烟苗叶片中木质素含量在低温胁迫处理后升高，其中6 h低温胁迫处理后差异即达到显著水平（p<0.05），低温胁迫处理较对照处理高46%，在胁迫处理12 h后木质素含量持续增加，表明多酚物质的合成与降解在低温胁迫下存在动态平衡，上游代谢物质可能向下游木质素合成转移。

2.4 低温胁迫对烟苗多酚代谢关键酶活性的影响

由图5可知，低温处理后烟苗中PAL活性先升高后降低，低温处理12 h时PAL活性最高为33.0 U/g鲜质量，显著的高于对照处理的27.1 U/g鲜质量；随着低温胁迫时间的增加，PAL活性降低。低温胁迫条件下，苗期烟叶中HCT活性与PAL活性变化规律相同，12 h低温胁迫处理时活性最高分别为32.2和33.0 U/g鲜质量。然而，低溫胁迫处理后烟苗叶片中POD活性呈增加趋势，在12和24 h分别增加17.4%和9.8%。

2.5 低温胁迫对烟苗多酚代谢相关基因表达的影响

由图6可知，低温胁迫条件下烟苗叶片中多酚代谢关键基因的表达量均有不同程度的提高，但不同基因之间变化规律存在差异。PAL1、PAL2、PAL3和PAL4是编码PAL酶的同源基因，在低温条件下均显著地上调表达，除PAL1低温处理后表达量持续增加外，PAL 2、PAL 3和PAL 4三个基因在低温处理12 h时达到最高值，24 h低温处理后表达量下降，但仍显著地高于对照处理。HCT基因在低温条件下表达水平显著提高，其中12和24 h提高了6.6和1.7倍。POD基因表达量在低温胁迫条件下显著增加，12和24 h分别增加了1.4和1.2倍。

3 讨 论

低温、干旱和光照辐射等环境胁迫均会诱导植物体内多种多酚物质的代谢变化[25-27]，在植物抵御环境胁迫中发挥着重要的作用[28]。多酚物质合成下游产物木质素是细胞壁的重要组成部分，可以提高植物对生物和非生物胁迫的抗性，为植物提供机械支持，木质素含量下降使植物在环境胁迫时更加脆弱[29-30]。因此，环境胁迫时木质素含量的变化是判断植物抵御环境胁迫的重要指标。在本研究中，低温胁迫处理后植物总酚含量少量下降，而木质素含量显著地增加，因此推测，木质素作为多酚物质代谢的下游产物，在低温胁迫条件下多酚物质降解向木质素合成方向转移，在环境胁迫存在时起到保护细胞结构的重要作用。

BARCEL等[31]研究报道了植物中过氧化物酶活性与细胞壁硬化有直接的关系。后来研究表明，在木质素合成过程中，低温胁迫时H2O2含量水平和POD活性升高共同促进木质素含量的增加[33]。在本研究中，在低温胁迫前期（12 h之前）总抗氧化能力（T-AOC）下降，不能及时清除过多的H2O2，造成H2O2积累和含量水平的增加，促进了多酚物质在POD酶的作用下合成木质素以及低温胁迫后期抗氧化能力的升高。因此，在低温胁迫条件下烟苗中木质素合成过程可能会与抗氧化酶共同清除低温胁迫产生的氧化胁迫物质，进而增强植株的低温抗性。

木质素的合成通过一系列的酶参与，其中包括关键酶PAL、HCT和POD等。PAL是苯丙烷代谢途径中调控多酚类物质生物合成的第一个酶，也是酚类物质代谢的关键酶和限速酶[32]。在本研究中，低温胁迫条件下PAL的上调表达和PAL活性的升高表明，低温胁迫可以快速促进多酚物质的合成，促进苯丙烷代谢途径中间代谢产物的增加。HCT是木质素生物合成途径的一个上游基因，在木质素前体松柏醇和芥子醇合成中扮演着重要的角色，通过其表达修饰可能会改变木质素含量的变化[33]。木质素的合成是在POD和其他氧化聚合酶在H2O2存在时催化木质素前体聚合的过程[34]。因此，低温胁迫条件下上游基因PAL和HCT基因表达水平上调和其酶活性升高促进多酚物质的合成，并在下游POD基因表达水平上调和其酶活性升高的作用下促进多酚物质的降解和木质素的合成，最终多酚物质流向木质素的生物合成。

4. 结 论

在低温胁迫条件下烟苗中木质素的合成代谢在抵御环境胁迫中起到重要的作用；低温胁迫条件下PAL、HCT和POD基因表达水平上调和其酶活性升高促进多酚代谢增加木质素合成，通过提高木质素含量增强细胞壁的保护作用是植物抵御环境胁迫的重要机制；同时木质素的合成与SOD、POD等抗氧化酶在清除因胁迫产生的H2O2中扮演着重要的角色。

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